癌胚抗原T、B細胞表位短肽誘導特異性體液免疫反應研究

陳 江 肖德雙 吳 樂 蔣佩佩 邵歡義 應江輝 朱珊麗 薛向陽 張麗芳 朱冠保

癌胚抗原(CEA)是腫瘤相關抗原［1］。正常情況下CEA經胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時的CEA則進入血和淋巴循環(huán)，引起血清CEA異常增高。分泌CEA的腫瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。既往的研究已證實，CEA可誘導機體產生特異性細胞和體液免疫，從而抑制體內腫瘤細胞生長，因此CEA是腫瘤疫苗研究的靶抗原之一。目前，基于CEA的一些細胞表位已被鑒定，本實驗室也對CEA的B細胞表位進行了分析報道［2～4］。本研究在既往研究基礎上，選擇富含T、B細胞表位的短肽基因，通過原核表達系統(tǒng)制備多表位融合蛋白并分析其誘導機體產生特異性體液免疫反應的特征，為該短肽的進一步應用研究奠定基礎。

材料與方法

1．材料:(1)主要試劑:限制性核酸內切酶XholⅠ、BamHⅠ、IPTG和預染蛋白Marker購自MBI公司。6×His－Tag單克隆抗體購自Bethyl公司、HRP－山羊抗小鼠IgG(H+L)及HRP－山羊抗兔IgG(H+L)抗體購自MultiSciences公司。金屬螯合純化試劑盒Ni－NTA購自德國QIAGEN公司。胎牛血清、細胞培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Gibco公司。弗氏佐劑購自Sigma公司。膜蛋白提取試劑盒(Membrane Protein Extraction kit)購買自上海BestBio生物技術公司。(2)質粒和細胞株:原核表達載體pET32a(+)和E．coli BL21(DE3)菌株由本實驗室保存。Lovo細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。(3)動物:健康日本大耳白兔，雌性，體重1．8～2.4kg，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2．方法:(1)CEA多表位短肽的預測、篩選:CEA氨基酸序列來自GeneBank公布的數(shù)據(jù)(M17303)。根據(jù)本實驗室已預測結果，經綜合比較分析，評判確定CEA的B細胞優(yōu)勢表位，篩選B細胞表位基因。CTL細胞表位的預測應用SYFPEITHI超基序法遠程預測由9個氨基酸殘基組成的CEA的CTL表位，即利用Intenet網絡進入SYFPEITH I主頁(http://www．uni－tuebingen．de/uni/kxi)介紹的方法，對 CEA 的HLA－A*0201限制性CTL表位及HLA－A24和H2－Kd進行遠程預測［4，5］。(2)CEA多表位目的基因的獲得:選擇CEA蛋白序列中含有抗原指數(shù)較高的B表位，同時選擇位于B表位上下游的分值較高的HLA－A2，A24及H2－Kd限制性的CTL表位作為多表位的組成成分，共同組成含CTL和B細胞表位的多表位肽。即篩選CEA氨基酸序列580～598區(qū)域(NRSDPVTLD VLYGPDTPII)的基因進行研究。并選取原核系統(tǒng)偏愛的氨基酸密碼子進行密碼子優(yōu)化確定核苷酸序列，分別設計核苷酸的正、反鏈，并在其上、下游引入限制性內切酶XhoⅠ(酶切位點為CTC GAG)和BamHⅠ(酶切位點為GGATCC)的酶切位點，其序列如下:正向引物:5'gatc caaccgcagcgatccggtcactttagacgtcttgtatgggcccgatactccgattattc 3';反向引物:5'tcgagaataatcggagt atcgggcccatacaagacgtctaaagtgaccggatcgctgcggttg 3'。上述序列委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將合成的互補寡核苷酸分別退火，獲得雙鏈的目的基因。(3)CEA多表位基因重組質粒的構建和鑒定:通過XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點，將獲得雙鏈的目的基因克隆到pET32a(+)載體，構建重組質粒pET32a(+)/CEA580～598多表位，并通過測序鑒定。(4)CEA多表位基因重組質粒的原核表達和鑒定:將鑒定后的陽性質粒轉化E．coli BL21(DE3)后，接種于LB培養(yǎng)液(100μg/ml Amp)，37℃培養(yǎng)過夜。加入 IPTG(終濃度為1mmol/L)誘導4h，10000×g離心5min收集細菌。取IPTG誘導前和誘導4h的菌液，經PBS洗滌、離心、超聲破菌，10000×g離心10min收集上清，進行SDS－PAGE分析。同時，以小鼠抗6×His單克隆抗體為一抗和HRP－山羊抗小鼠IgG(H+L)為二抗，進行Western blotting分析。(5)CEA多表位融合蛋白的的純化:收集誘導表達后的菌液，5000×g于4℃離心 10min，收集菌體，pH8．0的 Buffer B(8mol/L尿素，100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris－ Cl)重懸，并加入 PMSF至終濃度為1mmol/L，冰浴中超聲破菌、離心后，用Ni－NTA Agarose柱純化、洗脫，收集蛋白峰。(6)Western blotting分析:CEA多表位融合蛋白經SDS－PAGE電泳分離后，轉印至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉－TBST于4℃封閉過夜，漂洗3次后加入1∶5000稀釋的小鼠抗6×His單克隆抗體或1∶200稀釋的免疫兔血清為一抗，37℃震蕩孵育1h，漂洗3次后加入1∶2000稀釋的HRP－山羊抗小鼠 IgG(H+L)或1∶5000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)為二抗，再于37℃震蕩孵育1h，漂洗3次后DAB顯色。(7)動物免疫:日本大耳白兔隨機分為3組，每組3只。分別用純化的CEA多表位融合蛋白、Trx－His(空載載體蛋白)和PBS與等體積福氏佐劑充分混勻進行背部皮內多點注射免疫。抗原免疫劑量100微克/只(體積500μl)，隔2周加強免疫，共3次。于末次免疫后第2周心臟采血分離免疫血清。(8)免疫血清特異性抗體ELISA檢測:根據(jù)膜蛋白提取試劑盒(BestBio公司)操作手冊，提取Lovo細胞的膜蛋白作為天然CEA抗原。分別以純化的CEA多表位融合蛋白抗原(2μg/ml)和天然CEA抗原(Lovo細胞膜蛋白)(1×107/ml)包被ELISA反應板，5%脫脂奶粉封閉，PBST洗滌5次，每孔加入稀釋的兔免疫血清，置37℃ 2h，PBST洗滌5次，每孔加入1∶2000稀釋的HRP－標記的100μl山羊抗兔IgG(H+L)，置37℃ 1h，PBST洗板5次后OPD顯色，每孔加入50μl的2mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測A490值。每份血清標本均重復3孔檢測，并設標準陽性對照和陰性對照。

結 果

1．CEA多表位預測和篩選結果:根據(jù)SYFPEITH I法預測分值均較高(分值＞20)的CTL表位，結合本實驗室既往B細胞表位預測的結果(NRSDP)，選擇在其序列下游的多個CTL表位序列(PVTLDVLYGPDTPII)，即 CEA580～598(NRSDPVTLDVLYGPDTPII)共同組成CEA多表位目的短肽。其中CEA580～584為預測的B細胞表位，CEA589～597為HLA－A2限制性CTL表位，CEA590～598既為 H2－Kd限制性CTL表位又為HLA－A24限制性CTL表位(圖1)。

圖1 CEA580～598短肽表位分布

2．CEA多表位重組質粒構建和鑒定:將引物退火，得到含CTL、B細胞表位的目的基因，分別插入經XhoⅠ和BamHⅠ酶切純化得到的pET32a(+)質粒，構建重組質粒pET32a(+)/CEA580～598。重組質粒經測序結果經BLAST分析顯示插入的表位基因序列與設計的堿基序列完全一致(圖2)。

圖2 CEA多表位重組質粒測序圖

3．CEA多表位重組質粒的表達及目的蛋白純化和鑒定:轉化入E．Coli BL21(DE3)的陽性單克隆菌落經終濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達和SDSPAGE分析，結果顯示:IPTG誘導6h后，在分子質量約21kDa可見特異性的染色條帶，與預期融合蛋白的分子質量相等(圖3A)，經Bandscan軟件分析該蛋白表達量占總蛋白的25．6%。進一步將誘導表達后的細菌超聲破碎、離心，取上清通過Ni－NTA Agarose親和層析柱分離純化，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，經Western blotting檢測，顯示在分子質量約21kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，空載體轉化的E．Coli BL21(DE3)則在分子質量約18kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，未轉化的E．Coli BL21(DE3)均未顯示陽性信號條帶(圖3B)。以CEA陽性大腸癌患者血清為一抗，經Western blotting檢測，顯示在分子質量約21kDa處出現(xiàn)特異性陽性信號條帶，而空載體和未轉化的E．Coli BL21(DE3)均未顯示陽性信號條帶(圖3C)。

圖3 純化的CEA多表位融合蛋白SDS－PAGE電泳及Western boltting分析

4．CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體效價ELISA分析:CEA580－598融合蛋白以1．0μg/ml濃度包被酶標板，采用ELISA法檢測CEA多表位融合蛋白、Trx－h(huán)is和PBS兔免疫血清的抗體效價。CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體水平明顯高于Trxhis和PBS對照組(圖4)。

圖4 不同稀釋度CEA多表位融合蛋白免疫血清抗體效價ELISA分析

5．CEA580～598短肽兔免疫血清對天然CEA抗原的反應:用Lovo細胞提取的膜蛋白作為包被抗原，ELISA方法檢測末次免疫后2周的CEA580～598兔免疫血清對天然CEA抗原的識別能力，分別以Trx－h(huán)is和PBS免疫兔制備的兔血清抗體為對照。結果，CEA多表位免疫血清抗體水平(0．390±0．100)顯著高于Trx－h(huán)is對照組(0．045 ±0．030)和 PBS 對照組(0．034 ±0.027)，3組比較具有顯著性差異(P≤0．05)(圖5)。

圖5 ELISA檢測不同免疫組血清對天然CEA抗原的識別

討 論

CEA是最常見的腫瘤標志物。文獻報道CEA在胃腸道腫瘤、乳癌、肺癌及大多數(shù)上皮來源的腫瘤患者血清中有不同程度的升高，且血清CEA水平與病程進展和復發(fā)有一定的平行相關關系［1，6～8］。因此，CEA是腫瘤診斷和病情監(jiān)測中最常用的一種腫瘤標志物。CEA檢測對消化系統(tǒng)惡性腫瘤的早期診斷、療效觀察、提示復發(fā)轉移及治療方案的選擇具有較大的參考價值。CEA尤其在大腸癌腫瘤組織中呈高表達，研究表明，CEA能誘導機體產生較強的細胞和體液免疫，并可抑制體內腫瘤細胞生長，因此，CEA是研究大腸癌腫瘤疫苗的候選靶抗原之一，且已經進入臨床Ⅰ期研究［2，9，10］。但是，由于與 CEA 具有機體某些蛋白如反應蛋白(NCA)和膽汁糖蛋白(BGP)等有共同序列，可能產生交叉廣泛而影響CEA全長蛋白作為疫苗的使用，因此研究者將研究目標聚集在CEA的多肽及表位的研究上，即可避免產生自身免疫反應，又可產生針對性的特異性免疫反應。

Li等［11］選擇CEA氨基酸序列625～667的多肽(CEA625～667)，此段序列含有兩個Th表位，將其單獨及重復3次串聯(lián)構建DNA疫苗，結果發(fā)現(xiàn)BALB/c經此DNA疫苗免疫可產生很強的T細胞增殖反應和血清抗體反應，重復肽則可誘導產生顯著的IFN－γ分泌水平及Th1反應。Saha等選擇抗－獨特型的CEA模擬表位(3H1)結合 HLA－A2限制的 CEA(691～699)和CAP1－6D沖擊DC細胞，聯(lián)合免疫小鼠，能誘導更強的CEA特異的CTL反應和抗瘤效應。劉晶等［12］選擇 HLA－A2限制的 CEA605～613表位，在其610位上以天冬氨酸代替天冬酰氨，合成修飾肽(CEA610D)，采用同種異體混合淋巴細胞與肽共孵育的方法分析其CTL活性，結果發(fā)現(xiàn)，修飾的CEA610D疫苗產生最強的肽特異性CTL活性、CTL所釋放的殺傷相關介質穿孔素和上清中IFN－γ的水平也最高。表明，表位或多肽能誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫，為CEA表位及多肽疫苗的研究打下了基礎。

本研究結合我們既往B細胞表位預測結果，根據(jù)SYFPEITH I法預測分值均較高(分值 ＞20)的CTL表位，選擇 CEA580～598(NRSDPVTLDVLYGPDTPII)短肽進行研究。該短肽包含有CEA B細胞表位，含多個Th細胞表位及多個HLA－A2、H2－Kd、HLA－A24限制性的CTL表位，為進一步的動物實驗與臨床實驗研究打下了基礎。

為獲得大量含表位肽的蛋白，本研究對 CEA CEA580～598的基因進行了大腸桿菌偏好的密碼子優(yōu)化，主要的改變是增加了 GC含量，結果 CEA CEA580～598在大腸桿菌中獲得了高效表達，表達量占總蛋白的25．6%。ELISA法檢測兔免疫血清顯示，日本大耳白兔經CEA多表位融合蛋白免疫3次后的免疫血清抗體水平明顯高于trx－His和PBS對照組。Western blotting進一步證實兔免疫血清與CEA多表位融合蛋白結合的特異性。提示，CEA多表位融合蛋白具較強的免疫原性。進一步以Lovo細胞制備的天然CEA抗原包被ELISA板檢測兔免疫血清，結果顯示，兔免疫血清較對照組血清IgG抗體的效價均值具顯著性差異，表明CEA580～598多表位融合蛋白識別Lovo細胞制備的天然CEA抗原，可進一步用于表達CEA的腫瘤檢測和免疫學應用的研究。同時，經CEA陽性患者血清為一抗的Western blotting檢測分析，表明患者的血清可識別CEA580～598多表位融合蛋白，提示本研究CEA580～598多表位融合蛋白具較強的免疫原性，為進一步研究CEA580～598短肽蛋白的功能及研制多表位疫苗打下了基礎。

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