紫外分光光度法測(cè)定參須中人參總皂苷的含量※

萬(wàn)玉華 戴 潔 黃春靜 劉家星 馮愛(ài)珍 劉 坤 何金澤

（1 霸王（廣州）有限公司，廣州510440； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006）

人參（Radix Ginseng）為五加科植物人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根，中國(guó)藥典記載，人參性平，味甘、微苦。歸脾、肺、心經(jīng)。具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津，安神的功效[1]。根據(jù)傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)，人參主根和須根均作為人參入藥，隨著人參炮制加工方法的發(fā)展，市場(chǎng)上逐漸出現(xiàn)人參主根和須根兩個(gè)不同的用藥部位，經(jīng)驗(yàn)普遍認(rèn)為人參主根的人參皂甙含量相高于參須，主根的市場(chǎng)價(jià)格也高于須根。目前研究人參的藥用部位多為其主根，對(duì)須根的研究比較少。本研究建立參須中人參總皂苷含量測(cè)定的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、快速，為參須的深入研究及質(zhì)量控制提供了更加可靠的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外分光光度計(jì)（Bluestar-A 北京萊伯泰科儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；分析天平（萬(wàn)分之一， SARTOIUSAG BS110S 北京賽多利斯天平有限公司）；高速勻漿機(jī)（A200-18G，上海昂尼儀器儀表有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-S型 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；超聲波清洗器（KQ3200B 昆山市超聲儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SH-B 鞏義市儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 參須藥材（購(gòu)買于廣州市清平藥材批發(fā)市場(chǎng)，批號(hào)：20100111、20100823、20100824）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院賴小平教授鑒定為參須藥材；人參皂苷 Re對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11041201）。香草醛（批號(hào)：20100315，天津市百世化工有限公司）；高氯酸（批號(hào)：20100904，天津市百世化工有限公司）；冰醋酸（批號(hào)：20090320，天津市百世化工有限公司)；乙醇（批號(hào)20100806，天津市百世化工有限公司），均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：取干燥的人參皂苷Re對(duì)照品6mg，精密稱定，置5ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得人參皂苷Re對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密移取儲(chǔ)備液2ml至10ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.2412mg/ml的人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：分別取 20100111批樣品約0.05g，0.1g，0.2g，置圓底燒瓶中，加75%乙醇50ml，加熱回流1.5h，放冷，濾過(guò)，濾渣用乙醇洗滌2～3次，收集濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，用20ml的蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。加乙醚萃取3次（20ml/10ml/5ml），棄去乙醚層。水層加入水飽和正丁醇萃取 4次（30ml/20ml/15ml/10ml），合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇至干，用甲醇分次洗滌、轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，甲醇定容。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取人參皂苷 Re對(duì)照品溶液 0.6ml，加入 5%的香草醛醋酸溶液 0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻即得待測(cè)定對(duì)照品溶液[4]。同時(shí)取供試品溶液0.6ml，按待測(cè)對(duì)照品溶液的顯色方法進(jìn)行顯色制備即得待測(cè)定供試品溶液。

照紫外-可見(jiàn)分光光度法（2010版藥典附錄V A ）[5]測(cè)定。結(jié)果：人參皂苷與香草醛-高氯酸試劑顯色后，于540-560nm處有明顯紫外吸收，而且在555nm處有最大吸收，所以選擇測(cè)定波長(zhǎng)為555nm。

圖1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取人參皂苷 Re對(duì)照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml 、0.8ml，水浴蒸干，加入 5%的香草醛醋酸溶液 0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸 5ml，搖勻[2]，于波長(zhǎng)555nm處測(cè)定各溶液的吸光度。以人參皂苷Re重量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參皂苷在24.12～193.00μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r為0.9996，回歸方程為Y=4.997X+0.002809。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.2412mg/ml人參皂苷 Re對(duì)照品溶液 0.6ml，加入 5%的香草醛醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻，于555nm處連續(xù)測(cè)定吸光度5次。結(jié)果測(cè)定值的RSD為1.8%，提示儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 20100111批樣品約 0.1g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備，精密量取 0.3ml，加入 5%的香草醛醋酸溶液 0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻，在顯色后20min、25min、30min、35min、45min、60min，于 555nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：在60min內(nèi)測(cè)定值的RSD為1.5%，表明溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)確定在顯色后1h內(nèi)測(cè)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取20100111批樣品約0.1g ，取6份，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備。分別精密量取供試品溶液各0.3ml，水浴蒸干，加入5%的香草醛醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻，于555nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算各份供試品溶液中人參皂苷含量。結(jié)果參須中人參總皂苷含量為 81.47mg/g，SD為2.0，RSD為2.5%，提示本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 人參皂苷 Re對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品0.04004g，置10ml容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得濃度為4.004mg/ml的人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

取20100111批樣品約0.05g，6份，精密稱定，再分別精密量取人參皂苷Re對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml，按照供試品制備方法制備，分別精密量取供試品溶液 0.3ml，水浴蒸干，加入5%的香草醛醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻，于555nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算每份溶液人參總皂苷含量。結(jié)果表明平均加樣回收率為102.3%，RSD為2.8%，提示該測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 測(cè)定各批次參須中人參總皂苷的含量 分別取批號(hào)為20100111，20100823，20100824參須藥材約0.1g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)中供試品溶液的制備方法制備。分別精密吸取待測(cè)溶液0.3ml至刻度試管中，水浴蒸干，加入5%的香草醛醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃下水浴加熱15min，冰水冷卻10min，加入冰醋酸5ml，搖勻，于555nm處測(cè)定吸光度。人參總皂苷百分含量按干燥品算，依次為 0.81%，1.01%，1.00%，均符合藥典人參總皂苷不得低于0.8%的要求，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次藥材含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

3 討論

本項(xiàng)目以人參總皂苷為指標(biāo)性成分，采用5%香草醛-高氯酸對(duì)溶液進(jìn)行顯色處理，顯色的原理為高氯酸使皂苷的羧基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙鍵系統(tǒng)，又在酸的作用下形成陽(yáng)碳離子鹽而顯色，從而可用紫外-可見(jiàn)分光光度法（比色法）測(cè)定總?cè)藚⒃碥盏暮俊?/p>

本研究采用紫外分光光度法測(cè)定參須中人參皂苷的含量，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可以作為參須中人參皂苷含量的測(cè)定方法。

[1]黎陽(yáng),張鐵軍,劉素香.人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(1):164-166.

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[5]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 2005年版一 部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:560.

[6]徐靜,賈力,趙余慶.人參的化學(xué)成分與人參產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2011,3(34):199-201.