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    翻轉(zhuǎn)腸囊法研究芒果苷在大鼠的腸吸收動(dòng)力學(xué)

    2012-12-06 08:03:58陳寶婷徐福平林愛華劉奕明
    關(guān)鍵詞:知母試液黃柏

    陳寶婷,徐福平,林愛華,劉奕明

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510120)

    芒果苷(mangiferin)是常用中藥知母的主要活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、退熱、鎮(zhèn)痛和抗寄生蟲等活性[1-3]。為深入探討芒果苷的腸吸收特性及與 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的關(guān)系,本文采用大鼠腸外翻模型,研究不同腸段、不同中藥環(huán)境(知母水煎液、知母-黃柏水煎液)以及P-gp抑制劑對(duì)芒果苷腸吸收的影響,為闡明芒果苷的腸吸收動(dòng)力學(xué)機(jī)制,理解藥對(duì)知母黃柏的作用基礎(chǔ),指導(dǎo)臨床遣方用藥和提高臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 藥品與試劑 芒果苷對(duì)照品(純度98%,天津市河北區(qū)雙吉色譜儀經(jīng)營(yíng)部);鹽酸維拉帕米注射液(verapamil,Ver,上海禾豐制藥有限公司,Lot:100501);環(huán) 孢 素 A(cycloporineA,CsA,Lot:040842HB);實(shí)驗(yàn)用黃柏(Lot:090705661)、知母(Lot:090705211),均購(gòu)自廣東康美藥業(yè)股份有限公司;乙腈,HPLC級(jí),F(xiàn)isher公司;磷酸為色譜純。Krebs-Ringer試劑(K 氏液:NaCl 7.8 g,KCl 0.35 g,NaHCO31.37 g,NaH2PO40.32 g,MgCl20.02 g,glucose 1.4 g,加純水定容至1 000 ml)。

    1.2 儀器 美國(guó)WATERS超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng);臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司);德國(guó)IKA MS1型渦旋混勻器;恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司);十萬分之一電子天平(Mettler Toledo,AB135-S 型)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD♂大鼠,體質(zhì)量(250±20)g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCKX(粵)0073276。

    2 方法

    2.1 供試液配制 芒果苷供試液:精密稱取芒果苷對(duì)照品20 mg,加適量二甲基亞砜(DMSO)超聲振蕩溶解,移至1 L容量瓶中,加K氏液定容,配制成濃度為20 mg·L-1的芒果苷供試液(DMSO終濃度<0.1%)。

    知母、知母-黃柏供試液:稱取知母15 g置于2 L圓底燒瓶中,加純水浸泡30 min后加熱回流提取3 次,每次1 h,3 次加水量分別為 500、300、300 ml,過濾,合并3次濾液,UPLC法測(cè)定芒果苷濃度[4],以K氏液稀釋得到芒果苷濃度為20 mg·L-1的知母供試液。稱取知母15 g、黃柏15 g,按上述操作配制芒果苷濃度為20 mg·L-1的知母-黃柏供試液。

    含Ver或CsA的芒果苷供試液:精密稱取芒果苷對(duì)照品10 mg,以少量DMSO振蕩溶解,分別加入Ver或CsA,以K氏液配成質(zhì)量濃度為芒果苷20 mg·L-1,Ver或 CsA 100 mg·L-1的供試液。

    2.2 芒果苷濃度測(cè)定方法 采用UPLC法測(cè)定芒果苷。色譜條件:WATERS ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm× 50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為0.1%磷酸-乙腈,梯度洗脫(乙腈:0 min為5%,5.5 min為18%);流速0.25 ml·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;柱溫 35℃;進(jìn)樣量 5 μl。

    2.3 大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn) 采用翻轉(zhuǎn)腸囊法[5]。大鼠隨機(jī)分組,每組5只,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,自由飲水。腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血后,分別取空腸、回腸各10 cm,結(jié)腸7 cm,放入K氏液中沖洗,至無內(nèi)容物流出,小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪,將腸管一端結(jié)扎于自制塑料套管,翻轉(zhuǎn)后結(jié)扎另一端,使之形成囊狀。向腸囊中注入2 ml空白K氏液,將其移入已有K氏液的玻璃槽中平衡10 min后換成供試液100 ml,實(shí)驗(yàn)過程中保持37℃恒溫,并向玻璃槽中通入0.95 O2/0.05 CO2,在給藥后30、50、70、90 min 從腸囊內(nèi)取樣200 μl,同時(shí)補(bǔ)足相同體積的空白K氏液。將樣品經(jīng)13 000 r·min-1離心5 min,微孔濾膜過濾后,取續(xù)濾液5 μl進(jìn)樣測(cè)定樣品中芒果苷含量。

    2.4 數(shù)據(jù)處理

    Q為藥物各時(shí)間的累積吸收量,Cn為n時(shí)間點(diǎn)的實(shí)際檢測(cè)濃度,Ci為樣品濃度。

    2.4.2 轉(zhuǎn)運(yùn)速率及表觀滲透系數(shù) Q對(duì)t做相關(guān)回歸分析,得出斜率除吸收表面積,求得轉(zhuǎn)運(yùn)速率Vt。表觀滲透系數(shù)按Paap=△Q/△t·A·C0計(jì)算,式中△Q為藥物在△t時(shí)間內(nèi)透過的量(μg);A為藥物透過的表面積(本模型中為腸腔中膜面積);C0為腸囊外側(cè)的初始給藥濃度。

    3 結(jié)果

    3.1 UPLC測(cè)定方法 K氏液、知母、知母-黃柏中其他成分對(duì)芒果苷的測(cè)定無干擾,專屬性較好(色譜圖見Fig 1);芒果苷在0.2~96 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=1.2×104X-2.2×103,r=0.9999;低、中、高(0.9,38.4,76.8 mg·L-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的芒果苷K氏液樣品日內(nèi)精密度RSD分別為0.54%,0.47%,0.29%;日間精密度RSD分別為1.36%,2.92%,1.92%。

    3.2 芒果苷在不同腸段的吸收情況 芒果苷在空腸、回腸、結(jié)腸均有不同程度的吸收,并且在同一腸段Q隨時(shí)間延長(zhǎng)呈線性增加(Fig 2)?;啬c的吸收參數(shù)Q90(90 min累積吸收量)、Vt和Paap均高于空腸組(P<0.05),芒果苷在不同腸段吸收趨勢(shì)為回腸>結(jié)腸>空腸,結(jié)果見Tab 1。

    3.3 P-gp抑制劑對(duì)芒果苷吸收的影響 在90 min內(nèi),Ver對(duì)芒果苷吸收有促進(jìn)作用但不明顯,而CsA組芒果苷在回腸的吸收量明顯高于單體組(Fig 3),Q90、Vt和Paap比單體組增大(P<0.05),提示芒果苷可能是P-gp底物,CsA明顯提高芒果苷在回腸的吸收,見 Tab 1。

    Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s,n=5)

    Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s,n=5)

    *P<0.05 vs jejunum;#P<0.05 vs mangiferin group at ileum

    Intestine Group Q90/μg Vt/μg·cm-2·min-1 Paap/×10 -4,cm·min -1 Jejunum mangiferin 2.9484 ±0.7518 0.0041 ±0.0015 2.0350 ±0.7706 Colon mangiferin 4.3720 ±2.8159 0.0068 ±0.0048 3.3825 ±2.3781 Ileum mangiferin 6.4824 ±3.3958* 0.0104 ±0.0058* 5.1788 ±2.8999*mangiferin+Ver 11.4448 ±5.8714 0.0171 ±0.0113 8.5363 ±5.6694 mangiferin+CsA 13.1990 ±4.0660# 0.0206 ±0.0080# 10.3113 ±4.0032#Zhimu 12.7180 ±5.8105# 0.0204 ±0.0097# 10.190 ±4.8758#Zhimu-Huangbai 5.1304 ±2.0214 0.0079 ±0.00343.9650 ±1.7129

    3.4 知母、知母-黃柏中芒果苷的吸收 Fig 3顯示,90 min內(nèi)知母組芒果苷在回腸的吸收量明顯高于芒果苷單體組和知母-黃柏組(P<0.05),Q90、Vt和Paap(Tab 1)比單體組和知母-黃柏組均升高(P<0.05),而知母-黃柏組與單體組比較芒果苷吸收無差異。

    Fig 1 UPLC chromatograms of mangiferin. A:Blank Krebs;B:Blank Krebs mixed with mangiferin;C:Sample from gut sacs.

    4 討論

    離體組織實(shí)驗(yàn)必須考慮腸囊可能因離體時(shí)間太長(zhǎng)而失去活性。文獻(xiàn)資料[6-7]報(bào)道目前實(shí)驗(yàn)大部分在60~90min內(nèi),時(shí)間過長(zhǎng)不能保證腸囊的生理活性,會(huì)導(dǎo)致腸囊的通透性發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)曾以測(cè)定腸囊內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液的乳酸脫氫酶的活力來評(píng)價(jià)腸細(xì)胞活性,結(jié)果顯示大鼠離體腸段在90 min內(nèi)可以保持腸細(xì)胞正?;钚?。

    Fig 2 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different intestinal segments(±s,n=5)

    本實(shí)驗(yàn)中芒果苷在空腸、回腸、結(jié)腸均有吸收,各個(gè)腸段Paap均大于1×10-4cm·min-1。回腸是芒果苷腸吸收的最佳部位,因此本實(shí)驗(yàn)選擇回腸進(jìn)一步研究P-gp抑制劑與知母、知母-黃柏對(duì)芒果苷吸收的影響。

    Fig 3 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different test solutions at ileum(±s,n=5)

    P-gp是由MDR1基因編碼的膜蛋白,具有將藥物從腸漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)到腸黏膜而排入腸腔的作用,從而導(dǎo)致藥物的吸收量減少[8]。在合用不同P-gp抑制劑后發(fā)現(xiàn),CsA可以提高芒果苷在回腸K氏液中的濃度(P<0.05),而Ver作用不明顯,但也有一定的促進(jìn)作用。此結(jié)果提示芒果苷可能是P-gp的底物。

    知母組中芒果苷的Q90、Vt和Paap高于芒果苷單體組和知母-黃柏組給藥(P<0.05),這提示在知母水煎液給藥組中,知母中其它成分明顯促進(jìn)了芒果苷的腸吸收;當(dāng)伍用黃柏后芒果苷的吸收減少。前期曾對(duì)知母黃柏配伍對(duì)芒果苷大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響[9]進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)知母中芒果苷的血藥濃度和AUC(122.4 mg·L-1·h)比單體組(AUC 為0.626 mg·L-1·h)升高,配伍(1 ∶1)黃柏后 AUC(94.36 mg·L-1·h)下降,但仍明顯高于單體組,同時(shí)達(dá)峰時(shí)間Tmax明顯延長(zhǎng),表明配伍黃柏在一定程度上延緩了知母中芒果苷的吸收程度和速度,這與知母伍用黃柏后清熱而不化燥、養(yǎng)陰而不助濕的功效相一致。本文知母中芒果苷吸收明顯高于單體,與前期研究結(jié)果一致。配伍黃柏由于吸收延遲,而翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)時(shí)間僅為90 min,因此可能導(dǎo)致知母-黃柏組與單體組的腸吸收差異未完全顯現(xiàn)。本研究也提示我們中藥活性成分處于不同的處方環(huán)境則具有不同的吸收過程,研究其體內(nèi)吸收應(yīng)考慮復(fù)方多成分間相互作用。

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