二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及機(jī)制

楊彩紅，張軒萍，吳博威，李青山

(山西醫(yī)科大學(xué)1.藥理學(xué)教研室、2.生理學(xué)教研室、3.藥學(xué)院，山西 太 原 030001)

隨著很多腫瘤預(yù)后的改善，患者生存率的提高，對(duì)多個(gè)正常器官和組織產(chǎn)生毒副反應(yīng)成為限制抗腫瘤藥物用量、阻礙療效發(fā)揮的主要問題，研發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物成為首選。本課題組將芳香異羥肟酸作為配體與有機(jī)錫合成，得到的系列芳香異羥肟酸類化合物已證實(shí)都具有高效廣譜的抗癌活性［1－2］。其中二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)這一全新結(jié)構(gòu)化合物作用尤為突出，使用 DBDCT對(duì)荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它們對(duì)SGC7901胃腺癌、Bel-7402肝癌等實(shí)體瘤有明確治療作用［3］，顯示了高效廣譜抗癌活性。在研究DBDCT的一般藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)DBDCT在體給藥可使血壓下降。DBDCT是否通過直接舒張血管作用而降低血壓?本研究選用大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)，觀察DBDCT對(duì)去甲腎上腺素和氯化鉀誘發(fā)的血管收縮的影響，并用多種工具藥探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物合成實(shí)驗(yàn)室提供。純度高于98%。

左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、吲哚美辛(Indomethacin，Indo)、溴化四乙胺(tetraethylammonium bromide，TEA)、格列苯脲(glibenclamide，Gli)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、氯化鋇(BaCl2)、HEPES和EGTA均購自Sigma公司。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司;HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫浴鍋購自成都儀器廠;張力換能器(JH-2)購自高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，♂，2～3月齡，體質(zhì)量250～300 g。

1.4 溶液配制 DBDCT溶劑配方:丙二醇 ∶檸檬酸緩沖液∶無水乙醇=4∶5∶1，檸檬酸緩沖液用生理鹽水配制，pH為3.40。

生理鹽溶液(physiological salt solution，PSS)，其成分為(mmol·L－1):NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5。

60 mmol·L－1-K+PSS，其成分為(mmol·L－1):NaCl 89.8，KCl 60，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5。

Free-Ca2+PSS，其成分為(mmol·L－1):NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，Glucose 11.1，HEPES 5，EGTA 0.5。

上述營養(yǎng)液均用1 mol·L－1NaOH將pH值調(diào)至7.4，預(yù)熱至37℃。實(shí)驗(yàn)中所述濃度均為浴管內(nèi)試劑的終濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)脈環(huán)制備 參考文獻(xiàn)方法［4］，取出胸主動(dòng)脈，迅速置入4℃預(yù)冷、氧飽和、pH值為7.4的PSS中，將動(dòng)脈剪成2～3 mm的血管環(huán)，水平懸掛在10 ml浴管內(nèi)，連接張力換能器，經(jīng)BL-420F計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力變化。浴管內(nèi)含有通以100%O2、pH值為7.4、37℃的 PSS，前負(fù)荷調(diào)為2 g，平衡1 h，使之維持基礎(chǔ)張力在2 g的恒定水平，每20 min換1次營養(yǎng)液。所有動(dòng)脈環(huán)用60 mmol·L－1KCl PSS液多次刺激，當(dāng)標(biāo)本對(duì)刺激收縮穩(wěn)定后，即連續(xù)2次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于5%時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)制備 將修剪干凈的胸主動(dòng)脈環(huán)兩端固定，用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過，連續(xù)2次。血管環(huán)懸掛穩(wěn)定1 h后，用60 mmol·L－1KCl PSS液刺激，達(dá)到坪值后加入ACh(10－5mol·L－1)檢驗(yàn)血管內(nèi)皮的完整性，舒張幅度不超過收縮幅度的5%時(shí)認(rèn)為內(nèi)皮去除完全。

1.5.3 大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張作用測(cè)定 采用內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，經(jīng)60 mmol·L－1KCl PSS液刺激，待張力平衡后，用PSS液沖洗，使血管環(huán)張力恢復(fù)到刺激前的穩(wěn)定張力水平后，加入NE(10－6mol·L－1)或 KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮，然后加入 5×10－6mol·L－1的 DBDCT，對(duì)照組加入等容量的溶劑，描記張力曲線。以加入10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算施加DBDCT后血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比，即加藥后舒張幅度與 10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮幅度的百分比。

1.5.4 L-NAME、Indo、4-AP、Gli、TEA、BaCl2對(duì) DBDCT效應(yīng)的影響 采用內(nèi)皮完整大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，待張力平衡后，用 NE(10－6mol·L－1)或 KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮血管，達(dá)到坪值后，分別加入LNAME(10－4mol·L－1)、Indo(10－5mol·L－1)、4-AP(10－3mol·L－1)、Gli(10－5mol·L－1)、TEA(10－2mol·L－1)或 BaCl2(10－3mol·L－1)，血管環(huán)張力進(jìn)一步改變達(dá)到坪值后，加入5×10－6mol·L－1的DBDCT;對(duì)照組為收縮達(dá)坪值后，直接加入5×10－6mol·L－1的 DBDCT。記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計(jì)算變化值，以 10－6mol·L－1NE 或 60 mmol·L－1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，比較兩組最大舒張百分比變化的差異。

1.5.5 DBDCT對(duì)血管平滑肌外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的影響 采用內(nèi)皮完整的成年大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)，血管穩(wěn)定后加入 NE 10－6mol·L－1，血管環(huán)收縮達(dá)坪值后洗脫，平衡1 h，然后用無鈣 PSS液(含EGTA 0.5 mmol·L－1)沖洗 3 次，并孵浴 3 min。DBDCT 組加入DBDCT 5×10－6mol·L－1，對(duì)照組加入溶劑，孵浴 20 min，然后加入 NE 10－6mol·L－1，可見血管環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮，待其舒張并平穩(wěn)后，向各管內(nèi)加入 CaCl22.5 mmol·L－1，可見血管環(huán)再次收縮并達(dá)峰值。記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計(jì)算變化值，以10－6mol·L－1NE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度作為100%，比較兩組無鈣液中NE和CaCl2最大收縮百分比的變化值。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以NE或KCl誘發(fā)的收縮幅度作為100%，計(jì)算加入DBDCT后的張力變化百分比。比較各組間在相同濃度時(shí)張力變化的差異。結(jié)果以±s表示，采用SPSS軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

Fig 1 Effect of DBDCT，vehicle on the contraction induced by NE(10 －6mol·L－1)in isolated thoracic aorta rings with intact endothelium(Endothelium+)or endothelium-denuded(Endothelium－)(±s，n=6)

2 結(jié)果

2.1 DBDCT對(duì)NE或KCl預(yù)收縮大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的作用以及內(nèi)皮對(duì)其作用的影響 DBDCT 對(duì) NE(10－6mol·L－1)、KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮的離體胸主動(dòng)脈環(huán)均產(chǎn)生明顯的舒張作用。DBDCT 5×10－6mol·L－1對(duì) NE(10－6mol·L－1)預(yù)收縮的離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用可從溶劑組的(0.47±0.63)%增大至(94.40±2.23)%，DBDCT 5×10－6mol·L－1對(duì) KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用則為(11.69±1.76)%，與溶劑組相比，兩組張力變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DBDCT 對(duì) NE(10－6mol·L－1)、KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮的去內(nèi)皮離體胸主動(dòng)脈環(huán)也具有明顯的舒張作用，與內(nèi)皮完整組相比，張力變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見Fig 1，2。

2.2 L-NAME、Indo對(duì)DBDCT減弱NE收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的影響 L-NAME、Indo孵浴后，DBDCT對(duì)NE誘發(fā)的血管張力變化與無阻斷藥時(shí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在NE預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入 L-NAME 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(112.65±13.12)%;對(duì)照組不加LNAME，直接加入 DBDCT 5×10－6mol·L－1，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。加入Indo后，DBDCT的舒張百分比為(93.59±3.48)%，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Effect of DBDCT，vehicle on the contraction induced by KCl(60 mmol·L －1)in isolated thoracic aorta rings in rats with intact endothelium(Endothelium+)or endothelium-denuded(Endothelium－)(±s，n=6)

2.3 4-AP、Gli、TEA、BaCl2對(duì) DBDCT 減弱 NE 收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的影響 4-AP、Gli孵浴后，DBDCT對(duì)NE誘發(fā)的血管張力變化與無阻斷藥時(shí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在NE預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入 4-AP 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(100.90±9.51)%;加入Gli后，DBDCT的舒張百分比為(92.25±2.90)%，與對(duì)照組不加阻斷藥直接加入DBDCT比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 3。

TEA、BaCl2孵浴后，DBDCT的舒張作用減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在NE預(yù)收縮的血管環(huán)上，分別加入 TEA 或 BaCl2，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比分別為(42.21 ±2.50)%和(42.43±3.12)%;與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Fig 3。

Fig 3 Effects of L-NAME(10 －4mol·L －1)，Indo(10 －5mol·L －1)，Gli(10 －5mol·L －1)，4-AP(10 －3mol·L －1)，TEA(10 －2mol·L －1)，BaCl2(10 －3mol·L －1)on the relaxation induced by DBDCT in isolated thoracic aorta rings pre-contracted with NE(10－6mmol·L－1)(±s，n=6)

2.4 L-NAME、Indo對(duì) DBDCT 減弱 KCl收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的影響 L-NAME、Indo孵浴后，DBDCT對(duì)KCl誘發(fā)的血管張力變化與無阻斷藥時(shí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

在KCl預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入L-NAME后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(17.40±3.28)%;對(duì)照組不加L-NAME，直接加入DBDCT 5× 10－6mol·L－1，其舒張百分比為(11.69 ±1.76)%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在KCl預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入Indo后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(15.15 ±3.05)%，與對(duì)照組不加阻斷藥直接加入DBDCT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 4。

2.5 4-AP、Gli、TEA、BaCl2對(duì) DBDCT 減弱 KCl收縮胸主動(dòng)脈環(huán)的影響 4-AP、Gli孵浴后，DBDCT對(duì)KCl誘發(fā)的血管張力變化與無阻斷藥時(shí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在KCl預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入 4-AP 后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(13.77±3.22)%，加入Gli后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比為(16.32 ±2.91)%，與直接加入DBDCT不加阻斷藥比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 4。

同上方法，TEA、BaCl2孵浴后，DBDCT的舒張作用減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在KCl預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入TEA或BaCl2后，DBDCT 5×10－6mol·L－1的舒張百分比分別為(8.94 ±1.09)%和(8.82±1.26)%，與不加BaCl2或TEA直接加入DBDCT比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of L-NAME(10 －4mol·L －1)，Indo(10 －5mol·L－1)，TEA(10 －2mol·L －1)，4-AP(10 －3mol·L －1)，BaCl2(10 －3mol·L －1)，Gli(10 －5mol·L －1)on the relaxation induced by DBDCT in isolated thoracic aorta rings pre-contracted with KCl(60 mmol·L－1)(±s，n=6)

2.6 DBDCT對(duì)NE在無鈣液中的縮血管效應(yīng)的影響 在無鈣 PSS液中，分別加入 DBDCT 5×10－6mol·L－1及同劑量溶劑，孵浴20 min后，加入 NE 10－6mol·L－1，血管環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮，溶劑組和 DBDCT 5×10－6mol·L－1組的 NE 的收縮百分比分別為(20.44±1.60)%和(1.89 ±0.32)%，DBDCT組與溶劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見Fig 5。待其舒張并平穩(wěn)后，加入CaCl22.5 mmol·L－1，血管環(huán)再次收縮，溶劑組和DBDCT組的收縮百分比分別為(91.87±2.16)%和(1.60±0.48)%，DBDCT組與溶劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見Fig 5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明，DBDCT對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)均有舒張作用，且其舒張作用在內(nèi)皮完整和去除內(nèi)皮離體動(dòng)脈血管環(huán)差異無顯著性，提示DBDCT對(duì)血管的舒張作用可能主要是直接作用于血管平滑肌。一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)是典型的內(nèi)皮釋放的血管活性物質(zhì)，具有強(qiáng)大的舒張血管的作用。進(jìn)一步的研究表明，在使用NOS抑制劑L-NAME和環(huán)氧合酶抑制劑Indo處理血管后，發(fā)現(xiàn)在NE或KCl預(yù)收縮的基礎(chǔ)上DBDCT舒張血管作用未被阻斷，提示NO途徑和PGI2可能未參加DBDCT的舒張血管作用。這些結(jié)果均證實(shí)DBDCT對(duì)血管的舒張作用與內(nèi)皮舒血管因子的釋放無關(guān)，而可能是直接作用于血管平滑肌。

Fig 5 Effects of DBDCT(5×10－6mol·L－1)on NE(10 －6mol·L －1)induced contractions of the rat thoracic aorta rings in free-Ca2+PSS and CaCl22.5mmol·L －1(±s)

K+通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力中具有重要作用，激活血管平滑肌上的K+通道，可引起細(xì)胞膜超極化，從而抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流，引起血管舒張［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道:在血管平滑肌上主要有4種鉀離子通道，即電壓依賴性鉀通道(KV)，內(nèi)向整流鉀通道(Kir)，鈣激活鉀通道(KCa)和 ATP敏感鉀通道(KATP)［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TEA、BaCl2可以抑制DBDCT的舒血管作用，Gli、4-AP對(duì)DBDCT的舒血管作用無明顯影響。提示，KCa及Kir通道參與了DBDCT的舒血管作用，KATP和KV通道可能未參與其舒血管作用。

Ca2+是引起血管平滑肌收縮的關(guān)鍵因子［7］，血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于細(xì)胞外內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)釋放。鈣內(nèi)流的途徑主要通過電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)、受體操縱性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)、鈣釋放激活的鈣通道以及其他離子載體(Na+/Ca2+交換體、漏通道等)［8］。NE 誘導(dǎo)的血管收縮是作用于血管平滑肌上的α1腎上腺素受體，引起受體調(diào)控的鈣通道開放，Ca2+內(nèi)流，但主要通過三磷酸肌醇(IP3)刺激內(nèi)貯Ca2+的釋放引起血管平滑肌收縮［9］。KCl使血管平滑肌細(xì)胞膜去極化而刺激血管收縮，其機(jī)制主要是使VDC開放，從而促使細(xì)胞外液中或與細(xì)胞膜疏松結(jié)合的Ca2+內(nèi)流［10］，從而引起平滑肌收縮。在本實(shí)驗(yàn)中，DBDCT可抑制KCl引發(fā)的血管收縮，表明DBDCT引起的血管環(huán)舒張可能通過抑制VDC介導(dǎo)的細(xì)胞外鈣內(nèi)流而舒張血管。DBDCT抑制NE引發(fā)的血管收縮，提示其可能抑制肌漿網(wǎng)鈣釋放和(或)抑制ROC。NE在無Ca2+PSS液中引起的短暫收縮是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的結(jié)果，加入CaCl2后引起血管平滑肌進(jìn)一步收縮被認(rèn)為是細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而產(chǎn)生的［11］。我們采用無Ca2+液和復(fù)Ca2+液的實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)DBDCT能抑制NE在無Ca2+液中所引起的血管平滑肌短暫收縮和復(fù)Ca2+后的持久收縮，證明DBDCT可能通過影響外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放發(fā)揮其舒血管作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DBDCT對(duì)NE和KCl誘發(fā)的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的收縮具有明顯的減弱作用，該作用無內(nèi)皮依賴性，與內(nèi)皮生成的NO和PGI2均無關(guān)，而可能是直接作用于血管平滑肌，與激活KCa和Kir通道，抑制鈣內(nèi)流和肌漿網(wǎng)鈣釋放。

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