新生大鼠缺氧缺血性腦損傷HIF-1α表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及干預(yù)研究1）

郭晉偉，陰懷清，閆煥利，范澤衛(wèi)，杜 洪

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）為新生兒期常見疾病之一，是圍生期窒息導(dǎo)致腦缺氧缺血性損害，引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是一種氧敏感轉(zhuǎn)錄激活因子［1］。以往研究顯示，在輕度缺氧條件下，HIF-1誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)性反應(yīng)，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用［2］。但是，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞暴露于慢性或極度缺氧時，HIF-1α的大量表達(dá)卻促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型，觀察HIF-1α表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及2-甲氧基雌二醇（2ME2）干預(yù)后的影響，以期闡明抑制HIF-1α表達(dá)后對缺氧缺血性腦損傷的影響及可能的作用，從而為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 一抗：兔抗鼠HIF-1α、caspase-3及二抗：即用型SABC試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。2-甲氧基雌二醇系美國Cayman公司提供，由于2ME2是脂溶性粉末物質(zhì)，采用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，用PBS稀釋使有毒物質(zhì)DMSO的濃度降為5%。

1.2 動物分組及模型制備 清潔級，封閉群，新生7d齡Wistar大鼠120只，雌雄不限，體重10g～15g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。采用完全隨機設(shè)計將大鼠分為假手術(shù)組、缺氧缺血組及2ME2干預(yù)組。其中后兩組又根據(jù)HIBD后處死動物的時間（HIBD后3h、6h、12h、1d、2d、3d、7d）隨機分為7個亞組，每組各8只。假手術(shù)組給予麻醉后切開頸部皮膚，僅分離左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，不予缺氧處理；采用經(jīng)典Rice法［3］制成HIBD動物模型；缺氧缺血組給予麻醉后切開頸部皮膚，分離結(jié)扎左側(cè)頸總動脈后置于缺氧艙中（含8%氧氣）2h制作HIBD模型。2ME2干預(yù)組于HIBD模型制作后即刻給予2ME2腹腔注射（10μg／g）。

1.3 標(biāo)本的制備 分別在 HIBD后3h、6h、12h、1d、2d、3d、7d處死各組動物，斷頭取左側(cè)腦組織，10%多聚甲醛室溫固定24h，切塊，石蠟包埋后，連續(xù)做冠狀切片。

1.4 HE染色 常規(guī)石蠟切片→二甲苯脫蠟→梯度酒精脫水→蘇木素→伊紅染色→二甲苯透明→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化

1.5.1 HIF-1α的檢測 切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后放置至蒸餾水，3%H2O2室溫孵育15min，枸櫞酸緩沖液高壓熱休復(fù)2min，降溫至室溫，PBS液洗2min×3次，滴加HIF-1α一抗（1∶200），濕盒置于4℃冰箱中過夜，復(fù)溫至室溫，PBS液洗2min×3次，滴加二抗：抗兔IgG抗體，37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2min×3次，用DAB顯色劑顯色（鏡下觀察顯色程度），切片放置自來水中終止，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.5.2 Caspase-3的檢測 用Caspase-3的一抗代替HIF-1α的一抗，稀釋濃度1∶200，熱修復(fù)時間1min 45s，其余步驟與HIF-1α的檢測相同。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.6 圖像分析 采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）進(jìn)行圖像采集與分析，在相同光亮強度和放大倍數(shù)（10×40）條件下統(tǒng)計陽性細(xì)胞平均灰度值，平均灰度值越高，陽性表達(dá)越弱，而平均灰度值越低，陽性表達(dá)越強。每只鼠3張片子，每張片子取4個視野，計算其均數(shù)進(jìn)行比較和分析。

1.7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法定量觀察凋亡細(xì)胞，按試劑盒提供的實驗步驟進(jìn)行操作。光鏡下觀察，胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。高倍鏡下（×400）在缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨機選取10個非重疊視野，計數(shù)500個細(xì)胞，計算陽性率即凋亡指數(shù)（AI），AI=陽性細(xì)胞數(shù)／觀察細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)觀察（HE染色） 假手術(shù)組各時間點腦組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞排列整齊。HIBD模型組神經(jīng)細(xì)胞水腫，神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞凋亡增多，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯。2ME2干預(yù)組各時間點腦組織病理變化較HIBD模型組減輕，神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量多，細(xì)胞排列尚規(guī)則，層次尚清晰。

2.2 HIF-1α和Caspase-3的免疫組化染色 光鏡下觀察，HIF-1α和Caspase-3陽性染色呈棕黃色的細(xì)顆粒沉積，陽性細(xì)胞表達(dá)見于大腦皮層和海馬，陽性著色在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均可見。陰性對照切片中HIF-1α和Caspase-3的免疫反應(yīng)產(chǎn)物較其他兩組明顯減少。

2.2.1 HIF-1α的表達(dá) HIF-1α在假手術(shù)組各時間點維持低水平表達(dá)，在缺氧缺血3h后開始增強，6h逐漸上升，12h達(dá)高峰，后逐漸降低，但仍高于正常水平（P＜0.05）。2ME2干預(yù)組各時間點HIF-1α的表達(dá)水平較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 HIF-1α在新生大鼠腦組織中的表達(dá)（x±s） 平均灰度值

2.2.2 Caspase-3的表達(dá) Caspase-3在假手術(shù)組各時間點維持低水平表達(dá)，在缺氧缺血3h開始增強，6h～24h逐漸上升，2d達(dá)高峰，3d～7d稍有降低，但仍高于正常水平（P＜0.05）。2ME2干預(yù)組各時間點Caspase-3的表達(dá)水平較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 Caspase-3在新生大鼠腦組織中的表達(dá)（x±s） 平均灰度值

2.3 TUNEL染色凋亡細(xì)胞計數(shù) 光鏡下對假手術(shù)組的腦組織皮質(zhì)部位進(jìn)行觀察，未見明顯的凋亡細(xì)胞。實驗顯示缺氧缺血后3h左側(cè)大腦皮質(zhì)部位即可出現(xiàn)凋亡細(xì)胞（凋亡細(xì)胞的3種變性形態(tài)：細(xì)胞皺縮；細(xì)胞核固縮，周圍有空泡形成；可見核碎片，單個圓形凋亡小體）；缺血缺氧后6h～12h，左側(cè)大腦皮質(zhì)部位凋亡細(xì)胞數(shù)明顯；1d～7d左側(cè)大腦皮質(zhì)部位凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，凋亡細(xì)胞呈深棕色，且范圍廣泛。2ME2干預(yù)組各時間點凋亡細(xì)胞計數(shù)較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 新生鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)（x±s）%

3 討 論

在缺氧的環(huán)境中，維持機體的氧平衡是十分重要的。HIF-1是一種氧敏感轉(zhuǎn)錄激活因子，是缺氧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β2個亞基組成的異源二聚體。其中HIF-1α為功能亞基，隨著氧濃度的變化對HIF-1起活性調(diào)節(jié)作用；HIF-1β為結(jié)構(gòu)亞基，不受氧濃度的調(diào)節(jié)，呈持續(xù)表達(dá)狀態(tài)。HIF-1α和HIF-1β形成異二聚體后成為有活性的HIF-1。激活的HIF-1對下游一系列靶基因進(jìn)行調(diào)控，一方面通過促進(jìn)血管和神經(jīng)再生、促進(jìn)EPO生成、改善能量代謝等，對缺氧缺血后的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用；另一方面，HIF-1可以誘導(dǎo)BNIP3和p53的穩(wěn)定表達(dá)而致神經(jīng)毒性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］。

在缺氧時，HIF-1α的表達(dá)升高對神經(jīng)細(xì)胞是保護(hù)作用還是誘導(dǎo)凋亡作用，目前仍有爭議。有文獻(xiàn)報道，HIF-1α的表達(dá)升高與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。研究表明，全腦缺血后海馬和皮質(zhì)區(qū)HIF-1α的表達(dá)升高伴隨著神經(jīng)元的凋亡和丟失［5］。最近Helton在研究HIF-1α基因敲除小鼠時，發(fā)現(xiàn)缺氧缺血狀態(tài)下相關(guān)凋亡基因表達(dá)降低，說明HIF-1α表達(dá)降低或缺失對神經(jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用［6］。本實驗研究結(jié)果顯示，在正常狀態(tài)下，HIF-1α低水平表達(dá)；缺氧缺血時，HIF-1α蛋白表達(dá)量增加，同時其下游凋亡因子Caspase-3及TUNEL染色凋亡細(xì)胞數(shù)也隨之增加；2ME2干預(yù)后，HIF-1α活性受抑制，蛋白表達(dá)量減少，同時也抑制了Caspase-3表達(dá)，減少了細(xì)胞凋亡。據(jù)此推測，HIF-1α過度表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在整個缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。

HIF-1α抑制劑2ME2是一種天然的雌激素衍生物，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HIF-1α的活性，從而抑制其下游靶基因（如BNIP3、VEGF）的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［7］。本實驗結(jié)果顯示，新生大鼠HIBD后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡與HIF-1α表達(dá)增加同步。2ME2可以抑制HIF-1α過度表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕了缺氧缺血造成的腦損傷。由此可見，在缺氧缺血性腦損傷病理生理過程中，HIF-1α過度表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞是有害的，HIF-1α的神經(jīng)保護(hù)作用不足以抵抗HIF-1α過度表達(dá)造成的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

目前，2ME2的研究主要集中于腫瘤的二期臨床治療［8］。缺氧缺血性腦損傷與腫瘤都具有HIF-1α過度表達(dá)這一特點，因此，本實驗設(shè)計應(yīng)用2ME2抑制HIF-1α過度表達(dá)，進(jìn)而闡明2ME2在缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但在2ME2的應(yīng)用劑量及注射時間的選擇上仍處于摸索階段，有待于進(jìn)一步研究。

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