“雞皮糙”山藥過氧化物酶的酶學特性*

李寧，董海洲，王兆升，李鐘濤，李睿

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

“雞皮糙”山藥產(chǎn)自山東省菏澤市陳集鎮(zhèn)，粉性足、多須根、質(zhì)膩、味甘甜、質(zhì)地硬、入水久煮不散、不易折斷、營養(yǎng)價值高，現(xiàn)已申請了國家地理標志保護產(chǎn)品［1］。但在山藥加工和貯藏過程中往往產(chǎn)生劇烈褐變，失去原有的乳白色澤，嚴重影響產(chǎn)品的外觀、風味及商品價值。果蔬的褐變主要由酶促褐變引起，與酶促褐變密切相關(guān)的酶類主要有多酚氧化酶(PPO)和POD［2］。目前，國內(nèi)對山藥酶促褐變的研究主要集中在PPO上，但Chilaka等人認為，POD在山藥褐變上也起著重要作用［3］。

POD是廣泛分布于植物中的一類氧化還原酶，可催化由過氧化氫參與的各種還原物質(zhì)的氧化反應。它能催化過氧化物對酚類物質(zhì)的氧化，導致組織褐變［4］。果蔬中大部分的風味改變和褐變與POD活力有關(guān)，POD的活力改變明顯地影響果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量［5］。目前，關(guān)于“雞皮糙”山藥POD酶學特性的研究尚未見報道。為此，本研究以新鮮“雞皮糙”山藥為材料，對其POD進行較為系統(tǒng)的酶學特性研究，以期為控制過氧化物酶引起的酶促褐變、減少其營養(yǎng)損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“雞皮糙”山藥:產(chǎn)地為菏澤市陳集鎮(zhèn)，新鮮優(yōu)質(zhì)(無病蟲害及機械損傷)。

1.2 試劑與儀器

PVP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、Na2HOP4、檸檬酸、愈創(chuàng)木酚、H2O2、NaHSO3、草酸、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉)、抗壞血酸、L-半胱氨酸等，均為分析純。

研缽、數(shù)顯恒溫水浴鍋、TGL16臺式高速冷凍離心機、AY202型電子天平、PHS-25型酸度計、T6新世紀紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 “雞皮糙”山藥POD酶液的制備

稱取清洗去皮后的“雞皮糙”山藥10 g于研缽中，加入2%的PVP、50 mL 0.1 mol/L pH 6.0的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液在冰浴條件下研磨成漿，4℃下浸提30 min后用4層紗布過濾。使用冷凍離心機以4 000 r/min將濾液離心15 min，取上清液，上清液即為POD粗酶液。

1.3.2 POD 活性的測定［6］

取pH6.0檸檬酸－磷酸緩沖液(0.1 mol/L)1.7 mL，分別加入1 mL濃度為40 mmol/L愈創(chuàng)木酚和濃度為40 mmol/L H2O2溶液(其最終體系中濃度為10 mmol/L)混勻，25℃下保溫5 min，加入0.3 mL POD粗酶液啟動反應，對照組以緩沖液代替酶液。在470 nm波長下測定吸光度的變化，每隔30 s記錄1次，共計3 min。1個酶活力單位定義為:測定條件下，每分鐘每毫升酶液使吸光度值改變0.001為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 pH值對POD活性的影響

用檸檬酸－磷酸鹽緩沖液調(diào)整反應體系的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10)，在 25℃條件下測定 POD 活力，以酶活力最高值為100%，計算相對酶活，研究pH值對POD活性的影響。

1.3.4 溫度對POD活性的影響

在最適pH條件下，調(diào)節(jié)反應體系溫度(10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)按 1.3.2 酶活測定方法分別測定POD酶活力，以酶活力最高值為100%，計算相對酶活，研究溫度對POD活性的影響。

1.3.5 POD的熱穩(wěn)定性

將 POD 酶液分別置于 60、70、80、90、100℃ 水浴中保溫 5、10、15、20、25、30 min 后，迅速冷卻，按1.3.2酶活測定方法測定POD殘留活性。

1.3.6 不同濃度H2O2對POD活性的影響

在測定酶活力的反應體系中，調(diào)節(jié)H2O2濃度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)，研究不同濃度H2O2對POD活性的影響。

1.3.7 POD的底物專一性

分別以鄰苯二酚、綠原酸、沒食子酸、焦性沒食子酸和愈創(chuàng)木酚為反應底物，研究不同酚類底物對POD活性的影響。根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，利用雙倒數(shù)作圖法，分別計算“雞皮糙”山藥POD對不同酚類底物的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax，底物親和力大小用Vmax/Km表示［7］。

1.3.8 金屬離子對POD活性的影響

在測定酶活力的反應體系中加入不同的金屬離子至終濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L，按1.3.2酶活測定方法測定POD殘留活性。研究不同金屬離子對POD活性的影響。

1.3.9 不同抑制劑對POD活性的影響

在測定酶活力的反應體系中加入不同濃度的Vc、NaHSO3、L-半胱氨酸、草酸、EDAT-2Na、檸檬酸、植酸等抑制劑，按1.3.2酶活測定方法測定POD殘留活性。研究不同抑制劑對POD活性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值，利用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對POD活性的影響

如圖1所示，當pH小于3.0時，隨pH的升高，POD活性增加緩慢;pH大于3.0時，POD活性快速增加，當pH為4.0時POD活性達到最大;此后，隨著pH的繼續(xù)增加，其活性迅速下降，故“雞皮糙”山藥POD最適pH為4.0。當pH小于3時，80%以上的POD活性被抑制;pH大于8時，約有70%的POD活性被抑制。由此可知，在“雞皮糙”山藥加工過程中，可以將pH調(diào)節(jié)在其活力相對較低的范圍內(nèi)，從而有效控制POD引起的酶促褐變。

圖1 pH對POD活性的影響

2.2 溫度對POD活性的影響

如圖2所示，在10～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，POD酶活性逐漸升高，35℃時酶活性達到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，酶活性又開始呈下降趨勢，并且溫度高于60℃時，POD活性急速下降。這說明“雞皮糙”山藥POD的最適溫度為35℃，采用較高溫度進行燙漂可以達到抑制POD活性的目的?！半u皮糙”山藥POD的最適溫度與馬鈴薯、花菜 POD的不同［8］，表明不同種類果蔬POD的最適溫度是有差異的。趙喜亭等人的研究指出，山藥POD的最適溫度為50℃［9］，本研究結(jié)果與之存在較大差異，這可能與山藥的品種等因素有關(guān)。

圖2 溫度對POD活性的影響

2.3 POD的熱穩(wěn)定性

如圖3所示，“雞皮糙”山藥POD的活性隨加熱時間的延長而降低，并且溫度越高活性下降趨勢越明顯。60℃水浴處理5 min，POD殘留酶活51%，處理30 min時仍有20%的殘留酶活;80℃水浴處理5 min，POD殘留酶活降至34.4%，處理30 min殘留酶活僅為5.9%;當溫度達到100℃時，處理5 min POD殘留酶活僅為17.1%，處理20 min則可使POD完全失活。因此，生產(chǎn)加工過程中可采用沸水燙漂的方式抑制POD活性。

圖3 POD的熱穩(wěn)定性

2.4 不同濃度H2O2對POD活性的影響

如圖4所示，在0～10 mmol/L范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度的增加，POD活性迅速上升，當H2O2濃度達到10 mmol/L時POD活性最高，隨著H2O2濃度的進一步增加，POD活性又出現(xiàn)下降趨勢。有研究表明，在植物體內(nèi)，POD的催化作用受H2O2濃度的影響，當H2O2達到一定濃度時，POD能夠發(fā)揮較大的催化作用，而超過這一濃度后，POD 的活性就會降低［8，10］。本研究也證明了這一點。

圖4 不同濃度H2O2對POD活性的影響

2.5 POD的底物專一性

根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，計算出“雞皮糙”山藥 POD 對不同酚類底物的Km和Vmax，采用Vmax/Km比值表示POD與底物親和力的大小，比值越大表明親和力就越大［7］。由表1可知，以綠原酸為底物時，其Km值最小、Vmax值最大，Vmax/Km比值最大。因此，綠原酸與“雞皮糙”山藥POD的親和力最大。而以沒食子酸為底物時，酶與底物基本無反應。根據(jù)Vmax/Km比值的大小，“雞皮糙”山藥POD與各底物親和力小依次為:綠原酸＞愈創(chuàng)木酚＞焦性沒食子酸＞鄰苯二酚＞沒食子酸。這與鐵棍山藥POD的底物親和性研究結(jié)果不同［9］。由此可以看出，同一果蔬不同的品種，其POD最適底物也存在差異。

表1 “雞皮糙”山藥POD氧化不同酚類底物的動力學參數(shù)

2.6 金屬離子對POD活性的影響

如圖5所示，不同金屬離子對“雞皮糙”山藥POD活性的影響存在很大差異。其中，Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+對POD有明顯的激活作用，并且隨濃度的增加激活作用增強;Na+具有一定的抑制作用;Mn2+、K+對 POD則具有明顯的抑制作用;低濃度(1.0 mmol/L)的Zn2+、Cu2+對POD有激活作用，而高濃度(10 mmol/L)的Zn2+、Cu2+則有一定的抑制作用。

圖5 金屬離子對POD活性的影響

2.7 不同抑制劑對POD活性的影響

如圖6所示，不同濃度的抑制劑對“雞皮糙”山藥POD活性均有不同程度的抑制作用，并且抑制作用隨抑制劑濃度的增加而增強。其中，檸檬酸、EDTA-2Na和NaHSO3對POD活性的抑制作用較弱，濃度為10 mmol/L時仍有50%以上的殘留酶活。植酸、草酸在低濃度范圍內(nèi)(0～1 mmol/L)對POD活性抑制作用不明顯，當濃度大于1 mmol/L時其抑制效果顯著增加。L-半胱氨酸和抗壞血酸對POD活性則有很好的抑制效果，在低濃度0.5 mmol/L時即可抑制50%的酶活性;當濃度為10 mmol/L時，POD殘留活性分別為15.8%和4.3%?？箟难釋OD抑制效果較好的原因可能與其能將酶促反應中間產(chǎn)物醌還原有關(guān)［11］;而L-半胱氨酸對POD抑制效果較好的原因可能與其能和中間產(chǎn)物醌生成穩(wěn)定的無色物質(zhì)，而阻止了黑色素的生成有關(guān)［12］。

圖6 不同抑制劑對POD活性的影響

3 結(jié)論

(1)“雞皮糙”山藥POD催化愈創(chuàng)木酚氧化反應的最適pH為4.0，最適溫度為35℃，高溫處理可有效抑制其活性。“雞皮糙”山藥POD與不同底物結(jié)合能力的強弱依次為:綠原酸＞愈創(chuàng)木酚＞焦性沒食子酸＞鄰苯二酚＞沒食子酸，其中綠原酸為最適底物。

(2)Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+對“雞皮糙”山藥POD有明顯的激活作用;Mn2+、K+對POD則具有明顯的抑制作用;低濃度的Zn2+、Cu2+對POD有激活作用，而高濃度的Zn2+、Cu2+則有一定的抑制作用?？箟难?、L-半胱氨酸、植酸、草酸、檸檬酸、EDTA-2Na、NaHSO3等7種抑制劑對POD活性均有一定的抑制作用，其中，抗壞血酸、L-半胱氨酸抑制效果最好，而檸檬酸、EDTA-2Na及NaHSO3的抑制效果較差。

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