大孔吸附樹脂分離純化核桃殼總黃酮*

宋倩，趙聲蘭，劉芳，陳朝銀，呂昌勇，劉彬球

1(昆明理工大學(xué)，云南昆明，650500) 2(云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明，650200)

核桃(Juglans regin Linn.)屬胡桃科，主要分布于亞、歐、美等大洲。核桃在我國(guó)栽培歷史悠久，資源豐富，面積、產(chǎn)量世界第一［1-2］，隨之而產(chǎn)生的核桃副產(chǎn)物也相當(dāng)?shù)目捎^。國(guó)內(nèi)外研究表明，胡桃青皮黃酮以及楸皮黃酮具有抗氧化、抗菌、降血壓、抗腫瘤等生物活性［3-4］。核桃副產(chǎn)物中的核桃殼除了含有大量的碳水化合物和粗纖維外，還含有黃酮類化合物，但是目前核桃殼主要作燃料用，造成資源的浪費(fèi)，其資源的開發(fā)利用尚存在很大潛力。大孔吸附樹脂性質(zhì)穩(wěn)定，吸附量大，具有較好的選擇性，再生處理方便［5-6］，廣泛用于中草藥中生物活性物質(zhì)的分離純化，尤其適用于黃酮類化學(xué)物的分離純化［7］。本實(shí)驗(yàn)通過比較 5種大孔吸附樹脂［8-10］(NKA-9、AB-8、X-5、HPD-100和D101)對(duì)核桃殼總黃酮的吸附解吸性能，篩選出較適合純化核桃殼總黃酮的樹脂，并對(duì)其動(dòng)態(tài)吸附特性進(jìn)行了研究，確定優(yōu)化工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃殼，采于云南省昭通市，干燥后粉碎成粉，過60目篩;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海同田生物技術(shù)股份有限公司;大孔吸附樹脂，河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司，5種大孔樹脂的物理性能見表1。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;紫外可見分光光度計(jì)，Amersham Biosciences;電子分析天平，上海菁海儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海瀘西分析儀器廠;HLD-2恒流泵，上海瀘西分析儀器廠。

表1 大孔吸附樹脂物理性能

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立

本實(shí)驗(yàn)采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法［11］測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取10mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶，60%乙醇定容，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，反應(yīng)6 min，再加入0.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液絡(luò)合6 min，加入4 mL 4%的NaOH，最后用30%乙醇定容，搖勻，顯色15 min，測(cè)定510 nm處吸光值，得到蘆丁溶液濃度c(mg/mL)與吸光度A的回歸方程為:A=12.395c+0.0027，R2=0.999 9。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 核桃殼總黃酮供試液制備

取粉碎好的核桃殼，干燥后過60目篩備用。提取條件:提取液為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，料液比1∶30(g∶mL)、溫度80℃、回流2 次(1.5 h/次)，合并濾液，按照1.3.1方法測(cè)定濾液中黃酮含量，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干制成核桃殼黃酮粗提物備用。

供試液:取核桃殼黃酮粗提物4 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，按照1.3.1的方法測(cè)定供試液中總黃酮的濃度為c0。供試液濃度為4 mg/mL，在實(shí)驗(yàn)過程中按要求進(jìn)行稀釋。

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

大孔吸附樹脂浸泡在體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中，充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇清洗至流出液加適量蒸餾水無混濁，再用蒸餾水洗至流出液無醇味。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCl溶液酸洗，蒸餾水洗至中性，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液堿洗，蒸餾水洗至中性，樹脂備用。

1.3.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

稱取預(yù)處理后的5種樹脂各5 g(濾紙吸干)分別裝入100 mL的錐形瓶中，加入4 mg/mL的核桃殼供試液20 mL，室溫下振蕩吸附12 h，分別吸取上清液2 mL，按1.3.1方法測(cè)定吸光值為c1。將吸附飽和的樹脂抽濾后，蒸餾水洗滌一次，移入100 mL的錐形瓶，加入70%乙醇50 mL，振蕩解吸6 h，吸取上清液2 mL，測(cè)定吸光值為c2。

其中:c0為起始濃度(mg/mL);c1為平衡濃度(mg/mL);c2為解吸液濃度(mg/mL)，V為吸附液體積(mL)，m為樹脂質(zhì)量(g)。

1.3.4.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性的測(cè)定

綜合考慮各樹脂的吸附率和解吸率，選擇最適合的樹脂測(cè)定其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。準(zhǔn)確稱取大孔樹脂5 g(濾紙吸干)裝入錐形瓶中，加入4 mg/mL的核桃殼供試液20 mL，恒溫振蕩，在7 h內(nèi)每小時(shí)取上清液2 mL，測(cè)定吸光值，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4.3 上樣液pH值的確定

準(zhǔn)確稱取靜態(tài)實(shí)驗(yàn)所篩選樹脂5 g于三角瓶中，分別加入不同pH值的核桃殼供試液20 mL，恒溫振蕩，達(dá)到吸附飽和后取上清液2 mL，測(cè)定吸光值。

1.3.5 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

將預(yù)處理好的樹脂裝入1.2 cm×20 cm的色譜柱中，裝柱體積為20 mL。將核桃殼供試液調(diào)整到最適pH值上柱，對(duì)上樣濃度、流速、洗脫液濃度等進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中待樣液全部通過樹脂柱后，用去離子水洗至流出液無色，再用不同濃度的乙醇以一定速度洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總黃酮含量。

1.3.6 核桃殼黃酮回收率和純度的測(cè)定

將核桃殼供試液按最佳工藝上柱洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)黃酮濃度，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮后凍干，計(jì)算核桃殼黃酮的回收率和純度。

其中:c0為上樣濃度(mg/mL)，c3為洗脫液中黃酮濃度(mg/mL)，V0為上樣體積(mL)，V3為洗脫液體積(mL)，G為洗脫液凍干后質(zhì)量(mg)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用OriginPro7.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃殼總黃酮含量以及供試液黃酮濃度

按照上述提取方法得核桃殼粗提物的提取率為10.68%，核桃殼中總黃酮含量為3.38 mg/g，供試液濃度為4 mg/mL時(shí)，供試液中黃酮的濃度為0.143 mg/mL，經(jīng)計(jì)算粗提物中黃酮純度為3.58%。

表2 核桃殼中總黃酮含量

表3 供試液總黃酮濃度

2.2 不同大孔樹脂的吸附率和解吸率

由表4可以看出，極性樹脂和弱極性樹脂對(duì)于核桃殼總黃酮吸附能力較強(qiáng)，非極性樹脂的吸附能力相對(duì)較差，可能核桃殼黃酮具有一些多酚結(jié)構(gòu)或糖苷鍵結(jié)構(gòu)，有一定的極性和親水性，比較容易吸附于弱極性和極性樹脂上。AB-8和NKA-9吸附率比較高，解吸效果也比非極性樹脂好，說明核桃殼黃酮與非極性樹脂結(jié)合的比較緊密，較難洗脫;雖然AB-8的解吸率最好，可是從吸附率和解吸率綜合考慮，NKA-9是較適合于核桃殼黃酮的分離純化的大孔吸附樹脂。

表4 不同樹脂對(duì)核桃殼總黃酮的吸附率與解吸率

2.3 NKA-9樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特征

由吸附率和解吸率選擇較為合適的NKA-9樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖2所示。

圖2 NKA-9靜態(tài)吸附核桃殼黃酮?jiǎng)恿W(xué)曲線

由圖2可以看出，吸附時(shí)間3h后NKA-9樹脂的吸附量隨時(shí)間的增加變化很小，即樹脂已基本達(dá)到吸附飽和平衡。在較短的時(shí)間達(dá)到吸附平衡，說明這種樹脂對(duì)核桃殼黃酮的吸附屬于快速平衡型，快速吸附意味著可以縮短生產(chǎn)周期，這在工業(yè)上是很有利的。

2.4 上樣液pH值的影響

由圖3可以看出，隨著pH值的降低吸附量逐漸升高，說明一定的酸性條件有利于核桃殼黃酮的吸附，其原因可能是黃酮類化合物含有酚羥基和糖苷鍵，當(dāng)pH值較小時(shí)以分子狀態(tài)存在，主要依靠范德華力與樹脂進(jìn)行物理吸附;而在堿性條件下，以離子狀態(tài)存在，吸附比較困難［12］。但是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，pH值為3和4時(shí)在吸附過程中有絮狀沉淀產(chǎn)生，極易吸附在樹脂上，在上柱過程中就會(huì)容易阻塞樹脂柱，反而影響黃酮的吸附，綜合考慮選擇pH值為5作為上樣液的最適pH值。

2.5 NKA-9樹脂對(duì)核桃殼黃酮的動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.5.1 上樣濃度對(duì)核桃殼總黃酮吸附的影響

圖3 pH值對(duì)吸附特性的影響

流速1.0 mL/min，pH 5.0，上樣液黃酮質(zhì)量濃度分別為 0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL，每 10 mL 收集流出液測(cè)定滲透液中核桃殼總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線，如圖4所示。

圖4 不同上樣濃度的動(dòng)態(tài)吸附曲線

由圖4可以看出，核桃殼總黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)，吸附動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線比較靠近，隨著上樣體積的增加，在一定范圍內(nèi)滲透液中黃酮的質(zhì)量濃度變化不大，且含量比較低，泄漏不嚴(yán)重;但是上樣質(zhì)量濃度增加會(huì)使傳質(zhì)速度變慢，導(dǎo)致樹脂周圍的黃酮分子過多，使得部分黃酮沒來得及被吸附就流出來，使泄漏提前，最終導(dǎo)致樹脂的吸附量降低。所以上樣質(zhì)量濃度確定為1.0 mg/mL。

2.5.2 上樣流速對(duì)核桃殼總黃酮吸附的影響

上樣質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，pH值5.0，分別控制流速為0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min，每 10 mL 收集流出液，測(cè)定滲透液中總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線。如圖5所示。

圖5 不同上樣流速的動(dòng)態(tài)吸附曲線

由圖5可以看出，0.5和1.0 mL/min的動(dòng)態(tài)吸附曲線比較接近，而2.0和3.0 mL/min略高于0.5和1.0 mL/min;可能是流速較慢時(shí)總黃酮與樹脂接觸的時(shí)間較長(zhǎng)，有利于擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，減少了泄漏量，提高了吸附率。但是上樣流速過慢，操作時(shí)間長(zhǎng)，綜合考慮吸附率和效率，最終選擇上樣流速為1.0 mL/min。

2.5.3 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)核桃殼總黃酮吸附的影響

上樣質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，pH值5.0，上樣流速為1.0 mL/min，上樣量為10BV，上樣結(jié)束后用3BV體積的蒸餾水洗滌，然后分別用體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、95%乙醇溶液洗脫，每5mL收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線。如圖6所示。

圖6 不同洗脫體積的解吸動(dòng)力學(xué)曲線

由圖6可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，解吸效果越來越好。70%和95%乙醇的洗脫效果都比較好，解吸曲線尖銳，洗脫峰集中并且非常對(duì)稱，沒有明顯的拖尾跡象。但是相比較而言95%的解吸率更高，解吸完全。

2.5.4 核桃殼總黃酮回收率和純度

經(jīng)計(jì)算吸附前核桃殼粗提物中總黃酮純度為3.58%，NKA-9樹脂純化后測(cè)定純度為62.3%，總黃酮的純度大大提高，回收率為88.9%。如表5所示。

表5 核桃殼總黃酮回收率及純度

3 結(jié)論

通過對(duì)5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸研究，發(fā)現(xiàn)NKA-9型大孔樹脂效果比較理想，吸附率大、解吸率高，比較適合核桃殼總黃酮的分離純化。NKA-9樹脂對(duì)核桃殼總黃酮最佳上樣工藝參數(shù)為:上液樣pH值為5.0，上樣液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣流速為1 mL/min，吸附率相對(duì)較高，純化周期短。用95%的乙醇洗脫核桃殼黃酮，洗脫峰集中，對(duì)稱性好，無明顯的拖尾現(xiàn)象，5BV的95%乙醇基本上能將核桃殼總黃酮全部洗脫下來。吸附前核桃殼粗提物中總黃酮純度為3.58%，經(jīng)NKA-9樹脂純化后測(cè)定純度為62.3%，總黃酮的純度大大提高，回收率為88.9%。

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