淡豆豉藥材的高效液相指紋圖譜研究

廖麗娜，張明敏，曹尉尉，毛峻琴(.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥008;.解放軍第4醫(yī)院，上海 0008;.解放軍第85醫(yī)院，上海0005)

淡豆豉Semen Sojae Preparatum(SSP)是由豆科植物黑大豆Glycine max(L.)Merr.的黑色成熟種子與中藥青蒿、桑葉發(fā)酵加工而成，為藥食兼用的傳統(tǒng)藥物，我國各地均可產(chǎn)，具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱等功效［1］，其活性成分主要包括大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素等［2］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉異黃酮類成分具有抗骨質(zhì)疏松、保護(hù)血管、降血糖、降血脂、抗更年期綜合癥等多方面的功效［3，4］。目前淡豆豉的質(zhì)量控制僅限于外觀性狀、化學(xué)鑒別等項(xiàng)檢查，缺乏行之有效的質(zhì)量控制手段。因此建立有效地淡豆豉藥材質(zhì)量控制方法是一個(gè)亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)通過對不同省份的淡豆豉進(jìn)行了指紋圖譜研究，為淡豆豉的質(zhì)量控制提供可行性依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀配有二元泵，DAD檢測器，Agilent工作站。CPA225D Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海云飛生物科技有限公司);SHB-HIA循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 18.0。

1.2 試劑及藥品 大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素對照品均由中國食品藥品檢驗(yàn)所上海分所提供(批號依次為:111738-200501，111709-200501，111502-200101，111704-200501);乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，冰醋酸為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，雙蒸水，其它試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 淡豆豉藥材樣品11批，其中10批來源不同的省份，一份為自制藥材(根據(jù)2010版《中國藥典》炮制而成)。樣品來源見表1。

表1 11批淡豆豉藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 將淡豆豉藥材粉碎，過40目篩，精密稱取3.0 g，置圓底燒瓶中。加入甲醇100 ml回流提取，抽濾，濾液減壓濃縮，加甲醇定容至10 ml。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取大豆苷元，大豆苷，染料木素，染料木苷2 mg，置于20 ml容量瓶中，加甲醇定容。

2.3 色譜分析條件 色譜柱為Diamonsil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為 3%冰乙酸(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0～50 min，92% ～90%A;流速 1 ml/min;柱溫為30℃，檢測波長為261 nm，進(jìn)樣量為 10 μl。

2.4 方法學(xué)考察(方法學(xué)考察均采用編號S4藥材)

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μl，按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算其共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均小于1.0%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品5份，分別照“2.1”方法制備供試品溶液，按2.3色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD均小于1.0%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品溶液10 μl，每隔2 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD均小于1%(n=5)，說明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 淡豆豉藥材的指紋圖譜的建立 按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，對11批供試品進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并利用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以S1為參照譜，選取時(shí)間窗寬度為0.1 min，以平均法生成淡豆豉指紋圖譜，見圖1，確定25個(gè)峰為共有特征峰。特征峰的選取原則為11批淡豆豉都含有的21個(gè)峰和4個(gè)主要有效成分峰。在相同條件下測定對照品溶液，通過與對照品圖譜的比較，可知大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷的出峰時(shí)間分別為 22.066、28.891、38.62、43.352。

圖1 淡豆豉樣品HPLC指紋圖譜中共有色譜峰

2.5.1 不同產(chǎn)地淡豆豉藥材的HPLC圖譜及對照圖譜的相似度比較 按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別將不同產(chǎn)地的淡豆豉供試品進(jìn)行分析，記錄色譜圖，見圖2。利用中國藥典“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”，將11批淡豆豉藥材的HPLC圖與特征指紋圖譜峰比較，其相似度評價(jià)計(jì)算結(jié)果表明，11批供試品的相似度分別為0.788、0.822、0.811、0.601、0.820、0.857、0.793、0.734、0.792、0.954、0.777，均在0.70以上。從圖可見，原藥材的主要特征峰相同，說明不同產(chǎn)地的淡豆豉藥材的主要化學(xué)成分相同。

圖2 11批淡豆豉藥材HPLC指紋圖譜

2.5.2 黃酮類化合物的HPLC及與對照品的相似度 現(xiàn)在研究證明，淡豆豉藥材的黃酮類化合物是其主要的有效成分，11批淡豆豉藥材中4種黃酮成分的峰面積見表2。在計(jì)算相似度時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用以對照品的出峰時(shí)間為對照(20～50min)進(jìn)行比較，對11批淡豆豉藥材進(jìn)行圖譜處理，見圖3，并與對照品圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，其相似度評價(jià)計(jì)算結(jié)果表明，11批供試品的相似度分別為0.895、0.873、0.808、0.821、0.581、0.759、0.779、0.431、0.072、0.906、0.381。

圖3 11批淡豆豉藥材HPLC(20～50 min)指紋圖譜

表2 11批淡豆豉藥材中4種黃酮成分的峰面積

2.5.3 不同產(chǎn)地淡豆豉藥材的聚類分析 對11批淡豆豉樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，以各色譜峰的峰面積，利用歐氏距離，對樣品進(jìn)行聚類。11批淡豆豉藥材聚類樹狀圖見圖4。結(jié)合11批淡豆豉黃酮類的HPLC圖譜分析可分為3類:浙江、山東、自制、河南一類;云南、東北一類;河北、江西、福建、安徽、江蘇一類。

圖4 11批淡豆豉藥材的系統(tǒng)聚類分析圖

3 討論

3.1 提取方法及色譜條件的篩選 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件，從溶劑(甲醇，乙醇)、溶劑濃度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取方法(回流、超聲和冷浸)、提取時(shí)間(30 min、1 h、1.5 h、2 h)和提取次數(shù)進(jìn)行考察，采用HPLC進(jìn)行測定，綜合考慮確定優(yōu)化提取條件為:淡豆豉藥材粉末(過40目篩)3.0 g置圓底燒瓶中，加入80%甲醇100 ml回流提取1.5 h，抽濾后減壓蒸干，加甲醇溶解并定容至10 ml。本實(shí)驗(yàn)分別以乙腈-水、乙腈-3%醋酸、甲醇-水和甲醇-3%醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行比較，優(yōu)選乙腈-3%醋酸為色譜條件。

3.2 參照物的選擇 相似度在一定程度可以體現(xiàn)藥材的優(yōu)劣與真假，現(xiàn)已成為一種科學(xué)的評價(jià)方法，為中藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道淡豆豉的主要活性成分為異黃酮類，本研究以異黃酮大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素為指標(biāo)，綜合11批淡豆豉藥材的指紋圖譜信息分析。由于淡豆豉的發(fā)酵的原料，發(fā)酵中菌種的復(fù)雜性，發(fā)酵條件溫度、濕度等原因，使淡豆豉的成分有明顯的區(qū)別，并且經(jīng)HPLC圖譜可知，淡豆豉水溶性成分和極性較小的脂溶性成分很難達(dá)到分離，并且峰面積占總峰面積比例較大，致使其色譜峰的相似度差異不大，依此來評價(jià)淡豆豉質(zhì)量的優(yōu)劣并不準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)建立了對淡豆豉黃酮類有效成分的指紋圖譜相似度考察(20～50 min)和SPSS軟件進(jìn)行聚類分析，并結(jié)合種黃酮類成分峰面積可知:浙江、山東、河南和自制質(zhì)量較好，云南、東北次之，江西、江蘇、福建、安徽、河北質(zhì)量最差。其聚類結(jié)果與指紋圖譜相似度研究結(jié)果最為一致，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的淡豆豉黃酮類化合物的指紋圖譜能為更快速鑒別不同產(chǎn)地的淡豆豉藥材的質(zhì)量，更全面地對其進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)和控制提供參考。

［1］中國藥典2010版.一部［S］.2010:625.

［2］李 娜，黃慶柏.淡豆豉中的異黃酮成分及藥理作用與臨床作用［J］.中國現(xiàn)代中藥，2008，10(7):18.

［3］陳玉勝，張李陽.大豆異黃酮的藥理功效研究進(jìn)展［J］.四川生理科學(xué)雜志，2011，33(1):26.

［4］袁珊親，于能江，趙毅民，等.淡豆豉中的化學(xué)成分［J］.中藥材，2008 ，312(8):1172.