譜效結(jié)合在中藥提取純化工藝研究中的應(yīng)用

李雪靜，范成龍，宋洪濤(.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州35008;.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州35005)

提高中藥質(zhì)量，改變中藥“大、黑、粗”的狀態(tài)，讓中醫(yī)中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，對(duì)中藥的制備加工工藝提出了更高的要求，中藥有效成分的提取分離是其中的重要環(huán)節(jié)，有效成分的含量測(cè)定項(xiàng)目已成為評(píng)價(jià)提取中不可缺少的內(nèi)容，這關(guān)系到中藥提取物在臨床中的應(yīng)用療效。為了建立中藥制備工藝的優(yōu)選評(píng)價(jià)體系，對(duì)制備工藝進(jìn)行全程把關(guān)，對(duì)品質(zhì)進(jìn)行精確評(píng)價(jià)，越來(lái)越多的高新技術(shù)應(yīng)用于中藥提取分離過(guò)程中，譜效結(jié)合技術(shù)便是其中之一。

1 譜效結(jié)合技術(shù)的建立與發(fā)展

1.1 譜效結(jié)合技術(shù)的建立 “中藥譜效學(xué)”是一個(gè)近幾年才提出的概念，是指將標(biāo)示活性成分群特征峰的中藥指紋圖譜與藥效結(jié)果對(duì)應(yīng)起來(lái)，將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與中藥藥效結(jié)果聯(lián)系起來(lái)，從而建立中藥譜效關(guān)系，反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量［1］。

中藥和西藥不同，它的特點(diǎn)是作用的整體性。指紋圖譜反映的是中藥的化學(xué)信息，所檢測(cè)的特征指紋有可能并不包含中藥中的有效成分，因此不能直接體現(xiàn)中藥藥理活性信息，也不能直觀地反映中藥具有的療效。于是相關(guān)學(xué)者提出開展藥效與指紋圖譜相關(guān)性研究，即中藥譜效關(guān)系研究［2］。中藥譜效關(guān)系研究彌補(bǔ)了以化學(xué)指紋圖譜控制中藥質(zhì)量與藥效脫鉤的不足，可為中藥質(zhì)量控制提供更為科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。

1.2 譜效結(jié)合技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用 譜效結(jié)合技術(shù)目前在單味中藥、復(fù)方中藥、中藥制劑以及藥動(dòng)學(xué)的研究中應(yīng)用較多。實(shí)驗(yàn)研究較早的是寧黎麗等［3］對(duì)吳茱萸湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的方法學(xué)研究，該研究通過(guò)對(duì)吳茱萸湯進(jìn)行組方藥量變化，在原方基礎(chǔ)上按正交試驗(yàn)法組成9個(gè)不同配比的處方，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行HPLC分析和鎮(zhèn)痛與止嘔兩個(gè)指標(biāo)的藥理實(shí)驗(yàn)，對(duì)所得化學(xué)信息和藥理數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，確定吳茱萸湯主要色譜峰成分對(duì)藥效的歸屬。郭承軍等［4］應(yīng)用HPLC指紋圖譜方法分析給藥后模型小鼠血清藥物成分，研究金銀花抗流感作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及譜效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)綠原酸是金銀花抗流感作用的主要有效成分之一，另外尚有3～4個(gè)重要成分參與這一藥理過(guò)程。

在復(fù)方中藥方面，李鵬等［5］分析桃紅四物湯抑制小鼠痛經(jīng)有效部位的譜效關(guān)系，以闡明相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用己烯雌酚結(jié)合縮宮素致小鼠痛經(jīng)模型，對(duì)桃紅四物湯及其單味藥石油醚部位進(jìn)行篩選，并結(jié)合GC-MS法對(duì)其分析，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法將藥理數(shù)據(jù)與氣相色譜峰相對(duì)面積相關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明23號(hào)峰即亞油酸在延長(zhǎng)扭體潛伏期和減少扭體次數(shù)方面起主要作用，其次24號(hào)峰(十八碳烯酸)，45號(hào)峰(花生酸)和61號(hào)峰(二十七烷)對(duì)鎮(zhèn)痛效果有一定的協(xié)同作用。證明用譜效結(jié)合的方法，可以較客觀的分析評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)與效應(yīng)之間的關(guān)系。

在中藥制劑方面，盧紅梅等［6］對(duì)魚腥草注射液質(zhì)量控制中的譜效學(xué)進(jìn)行初步探討，以抗炎效果為例，為中藥的指紋圖譜建立提供新的思路。林立等［7］研究瀉白散HPLC譜效關(guān)系，將瀉白散方中各藥進(jìn)行正交組合，測(cè)定HPLC圖譜及評(píng)價(jià)祛痰、抗炎作用，并對(duì)HPLC圖譜進(jìn)行峰歸屬分析，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法將藥理數(shù)據(jù)和HPLC圖譜中各色譜峰面積相關(guān)聯(lián)，研究譜效相關(guān)性。結(jié)果證明桑白皮中有2個(gè)峰顯示與祛痰作用和抗炎作用呈正相關(guān)，初步推斷為二苯乙烯苷類成分。

在藥動(dòng)學(xué)方面，賀福元等［8］提出了中藥多成分體系藥動(dòng)學(xué)研究的新方法——總量統(tǒng)計(jì)矩法，即滿足在中醫(yī)宏觀要求(宏觀量化可算)的同時(shí)又滿足現(xiàn)代科學(xué)微觀可測(cè)(可按目前單個(gè)成分藥動(dòng)學(xué)方法進(jìn)行研究)的要求。

2 譜效結(jié)合技術(shù)在中藥提取純化中的應(yīng)用

2.1 中藥提取純化工藝的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 中藥、天然藥物的提取應(yīng)盡可能的提取出有效成分，或根據(jù)某一成分或某類成分的性質(zhì)提取目的物。不同的提取純化方法均有其特點(diǎn)和適用范圍，應(yīng)根據(jù)與治療作用相關(guān)的有效成分(或有效部位)的理化性質(zhì)，或藥效研究結(jié)果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選擇適宜的方法。復(fù)方提取純化的評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)考慮其多成分作用的特點(diǎn)，既要重視傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)、組方理論，充分考慮藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚的現(xiàn)狀，又要盡量改善制劑狀況，以滿足臨床用藥要求。在評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇上，應(yīng)結(jié)合藥物品種的具體情況，探討能夠?qū)ζ浒踩?、有效、質(zhì)量可控作出合理判斷的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，必要時(shí)可采用生物學(xué)指標(biāo)等。在提取純化研究過(guò)程中，有可能引起安全性隱患的成分應(yīng)納入評(píng)價(jià)指標(biāo)。

目前中藥制劑工藝逐漸形成了浸出物、指標(biāo)成分、大類成分、生物學(xué)方法、工程及經(jīng)濟(jì)指標(biāo)等評(píng)價(jià)指標(biāo)［9］。這些指標(biāo)各有其優(yōu)勢(shì)及局限性，浸出物可直接影響固體制劑的服用量與劑型選擇，影響液體制劑的澄明度與穩(wěn)定性，但未必真實(shí)的代表部分藥材及復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ);指標(biāo)成分技術(shù)含量高，更加精細(xì)，在一定程度上表明工藝研究的現(xiàn)代水平，是現(xiàn)有常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但并非所有藥材都具備使用指標(biāo)成分的基礎(chǔ)，能找到與療效密切相關(guān)的具備說(shuō)服力的指標(biāo)成分，即使具備這樣的指標(biāo)成分，但其未必真實(shí)反映中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)的特征;大類成分具有綜合性，但不夠精細(xì)，無(wú)法反映單一成分在工藝過(guò)程中的降解、轉(zhuǎn)化;生物學(xué)方法以工藝產(chǎn)物的藥理效應(yīng)評(píng)價(jià)工藝，具備說(shuō)服力，但生物學(xué)指標(biāo)的敏感性不足，未必可以反映不同工藝的優(yōu)劣［10］。

對(duì)于這些問(wèn)題，章臣桂提出了“抓住君臣、不放佐使;抓住有效物質(zhì)，不放協(xié)同效應(yīng)”的科研思路［11］?？偠灾?，中藥制劑工藝的評(píng)價(jià)經(jīng)歷了從無(wú)指標(biāo)到有指標(biāo)，評(píng)價(jià)指標(biāo)從籠統(tǒng)、模糊到精細(xì)，又從精細(xì)回歸綜合的過(guò)程。

2.2 指紋圖譜對(duì)中藥提純工藝評(píng)價(jià) 開展譜效相關(guān)性研究可以為中藥制劑工藝優(yōu)選建立較為完善的評(píng)價(jià)體系，可以選擇多組分考察指標(biāo)優(yōu)選提取純化工藝，并界定這些指標(biāo)的權(quán)重因子大小。由于資源的限制，中藥對(duì)照品的缺乏，對(duì)所有的藥效成分均采取含量測(cè)定，效率低，成本高，不太現(xiàn)實(shí)。選擇多個(gè)具有代表性成分進(jìn)行含量測(cè)定，在一定程度上保證質(zhì)量的有效性，中藥復(fù)方指紋圖譜在制備工藝應(yīng)用已有初步研究，通過(guò)指紋圖譜峰面積比較，可獲悉不同成分在不同工藝中的成分積累程度的差異，實(shí)現(xiàn)成分的含量相對(duì)大小比較。

車輛稱重時(shí)，希望僅通過(guò)調(diào)節(jié)空氣彈簧高度調(diào)整閥便能調(diào)平，同時(shí)要考慮在軸箱彈簧處加設(shè)墊片。當(dāng)僅調(diào)節(jié)高度調(diào)整閥時(shí)，ΔS為變量，所以式(4)和(5)所組成的方程組有解時(shí)，便說(shuō)明只調(diào)節(jié)高度調(diào)整閥就能調(diào)平。

王冬梅等［12］采用HPLC-UV-MS法測(cè)定了貫葉連翹及其提取物的指紋圖譜，并對(duì)主要色譜峰進(jìn)行定性定量分析，旨在對(duì)提取物制備工藝的有效性、穩(wěn)定性以及抗氧化劑、藥材采收部位對(duì)提取物質(zhì)量的影響進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果證明將極性較大的金絲桃素類和黃酮類成分與極性較小的貫葉金絲桃素類成分分別進(jìn)行提取，然后勾兌貫葉連翹提取物，這種提取工藝的穩(wěn)定性良好，可有效地富集金絲桃素類和黃酮類化合物。

吳永江等［13］研究3種不同的提純工藝對(duì)參麥注射液質(zhì)量的影響，用HPLC測(cè)定紅參藥材以及不同工藝提純的紅參中間體和參麥提取液的指紋圖譜，并測(cè)定人參皂苷Rg1、Re總量和Rb1含量以及參麥提取液中總皂苷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同工藝的紅參中間體和參麥提取液在指紋圖譜和人參皂苷含量上都有顯著的差異。用HPLC指紋圖譜法可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)不同工藝對(duì)參麥提取液質(zhì)量的影響。

陸臻等［14］為改進(jìn)丹參注射液的制備工藝，利用指紋圖譜來(lái)考察工藝的穩(wěn)定性。選擇明膠醇沉法對(duì)丹參注射液的制備工藝進(jìn)行改進(jìn)，采用HPLC法對(duì)多批樣品進(jìn)行考察，建立指紋圖譜來(lái)確認(rèn)制備工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果證明明膠沉淀法制備工藝穩(wěn)定可控。吳永江等［13］研究3種不同的提純工藝對(duì)參麥注射液質(zhì)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同工藝的紅參中間體和參麥提取液在指紋圖譜和人參皂苷含量上都有顯著的差異。用HPLC指紋圖譜法可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)不同工藝對(duì)參麥提取液質(zhì)量的影響。

2.3 譜效結(jié)合評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用 對(duì)于作用機(jī)制復(fù)雜但相關(guān)基礎(chǔ)研究薄弱的中藥，藥材在具體處方中發(fā)揮作用的有效成分和有效部位還不夠明確，一些含量較低或現(xiàn)有檢測(cè)手段未能反映的藥效成分就很有可能在中藥提純的過(guò)程中被當(dāng)做雜質(zhì)去除。故中醫(yī)藥業(yè)內(nèi)人士提出了全新的、處于學(xué)術(shù)前沿的中藥現(xiàn)代化研究思路，即建立在中藥指紋圖譜研究基礎(chǔ)上，但并不等同于中藥指紋圖譜，而是比指紋圖譜更深入一層的譜效關(guān)系［15］。

“譜效結(jié)合”評(píng)價(jià)方法的優(yōu)勢(shì)在于綜合考慮了物質(zhì)基礎(chǔ)及其效應(yīng)，將指紋圖譜技術(shù)運(yùn)用于工藝評(píng)價(jià)。將其作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，與大類成分相比更加精細(xì)，與單一成分相比更加全面。即使藥效物質(zhì)基礎(chǔ)在我指紋圖譜視野之外，藥效學(xué)指標(biāo)的復(fù)核也會(huì)避免工藝路線的差錯(cuò)。采用“譜效結(jié)合”的評(píng)價(jià)方法，有助于我們?cè)谏形赐耆盐账幉幕驈?fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的現(xiàn)有狀況下，減少因藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及協(xié)同作用的“黑箱”因素所導(dǎo)致工藝研究現(xiàn)差錯(cuò)的概率［16］。

王鳳云等［17］分別以HPLC指紋圖譜的主成分保留率和急性肝損傷的藥效模型為指標(biāo)，評(píng)價(jià)綿茵陳提取液的大孔吸附樹脂精制工藝的合理性。以HPLC指紋圖譜的主峰保留率為指標(biāo)，對(duì)綿茵陳提取液的精制工藝進(jìn)行評(píng)價(jià);建立CCl4致小鼠急性肝損傷模型，測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，并觀察肝組織病理學(xué)變化，進(jìn)行小鼠灌胃給藥的急性毒性實(shí)驗(yàn)，考察綿茵陳提取液精制前后口服給藥的安全性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿茵陳提取液精制前后的HPLC指紋圖譜基本一致，綿茵陳提取液精制前后的保肝作用無(wú)顯著差異，綿茵陳提取液精制前后均未發(fā)現(xiàn)明顯的急性毒性反應(yīng)。以HPLC指紋圖譜和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的評(píng)價(jià)方法，證實(shí)了綿茵陳提取液大孔吸附樹脂精制工藝的合理性。

3 結(jié)語(yǔ)

中藥譜效關(guān)系學(xué)的研究雖已提出多年，但是還沒(méi)有形成成熟穩(wěn)定的研究思路和方法，現(xiàn)有的研究?jī)?nèi)容也存在一些值得商榷的問(wèn)題。在譜效相關(guān)性研究過(guò)程中，如何確立化學(xué)指紋圖譜和生物指紋圖譜中的特征峰信息，如何將指紋圖譜所獲取的化學(xué)成分特征信息與生物效應(yīng)相關(guān)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采取什么數(shù)學(xué)模型和方法進(jìn)行化學(xué)特征與生物學(xué)特征信息關(guān)聯(lián)等等這些都是中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究的關(guān)鍵問(wèn)題。

而且，中藥在提純過(guò)程中溶媒、環(huán)境等因素都會(huì)對(duì)成分產(chǎn)生影響，而在藥效研究方面，很多西化的藥理模型不能全面的反映中藥的臨床功效。將指紋圖譜技術(shù)與藥效學(xué)結(jié)合，分析指紋圖譜主要色譜峰所對(duì)應(yīng)成分，再經(jīng)組合配比和主要藥效學(xué)驗(yàn)證，確定譜效相關(guān)性，優(yōu)化中藥提純工藝，將成為解決中藥質(zhì)量控制這個(gè)制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展問(wèn)題的主要途徑之一。

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