PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的機(jī)制*

呂振嶸， 王曉礽， 李玉珍， 王 琛， 劉秀華△

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室, 山東 濟(jì)南 250012；2中國人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室,北京 100853)

1000-4718(2012)07-1153-07

2012-03-05

2012-04-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81070130)

△通訊作者 Tel: 010-66939763; E-mail: xiuhualiu98@yahoo.com.cn

▲并列第1作者

·論著·

PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的機(jī)制*

呂振嶸1▲， 王曉礽2▲， 李玉珍2， 王 琛2， 劉秀華2△

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室, 山東 濟(jì)南 250012；2中國人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室,北京 100853)

目的研究蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)反應(yīng)在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用。方法在AngⅡ誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大模型上，采用[3H]-亮氨酸摻入、心肌細(xì)胞表面積測定等評估心肌細(xì)胞肥大程度；以實(shí)時(shí)定量PCR、RT-PCR和Western blotting檢測ERS標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF2α)和C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果與正常對照組比較，AngⅡ組CRT mRNA和蛋白表達(dá)分別高146.4%和125.3%(P<0.05)，GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)分別高84.0%和77.6% (P<0.05)，PERK mRNA和蛋白表達(dá)分別高165.4%和132.1%(P<0.05)，eIF2α mRNA和蛋白表達(dá)分別高110.9%和46.5%(P<0.05)，CHOP mRNA和蛋白表達(dá)分別高117.7%和63.3%(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)ERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

心肌肥大； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶

心肌肥大是由缺血、機(jī)械牽張、激素和細(xì)胞因子等因素引起的心肌細(xì)胞代償性反應(yīng)，心肌肥大失代償可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭和猝死，嚴(yán)重危及人類生命。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是真核細(xì)胞中調(diào)控蛋白質(zhì)折疊、Ca2+穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)的重要細(xì)胞器，對維持心肌細(xì)胞鈣離子和蛋白質(zhì)合成穩(wěn)態(tài)具有重要作用[1]。缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等應(yīng)激刺激均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress, ERS)。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)是ERS 3種感受蛋白之一[2]，通過磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，并通過促進(jìn)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein， CHOP)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是介導(dǎo)ERS整合調(diào)控反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號途徑之一[3]。本課題組前期研究證明[4]，ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG；抑制ER鈣泵繼而排空ER內(nèi)Ca2+)和衣霉素(tunicamycin，TM;抑制ER內(nèi)蛋白質(zhì)N端糖基化)可以直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。?；撬?taurine，Tau)是體內(nèi)含量最豐富的含硫自由氨基酸，可以抑制同型半胱氨酸等多種因素誘導(dǎo)的ERS，對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[5-6]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘導(dǎo)心肌肥大是目前最常用的實(shí)驗(yàn)性心肌細(xì)胞肥大模型之一，其致心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制尚未完全闡明。我們認(rèn)為PERK介導(dǎo)的ERS可能是AngⅡ致心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制。本工作在原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞AngⅡ誘導(dǎo)肥大模型上，研究ERS應(yīng)激分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin, CRT)以及PERK途徑相關(guān)分子表達(dá)的變化，證實(shí)PERK介導(dǎo)的ERS參與了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

材 料 和 方 法

1動物與試劑

清潔級SD新生(出生24 h內(nèi))乳大鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；新生牛血清購自PAA；胰蛋白酶購自Amresco；蛋白酶抑制劑購自Sigma；TRNzol-A+總RNA提取試劑、 2×Taq PCR MasterMix、電泳級瓊脂糖，購自北京天根生化科技有限公司；cDNA第1鏈合成試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成；TaqMan Gene Expression Master Mix和TaqMan熒光探針購自Applied Biosystems；蛋白電泳分子量(7～175 kD)標(biāo)記為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人CRT、 GRP78多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體和小鼠抗人CHOP單克隆抗體，購自Santa Cruz；兔抗人PERK和eIF2α多克隆抗體，購自Cell Signal；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz。

2乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

按本室報(bào)道的方法[7]培養(yǎng)乳鼠心細(xì)胞：出生24 h內(nèi)乳大鼠常規(guī)消毒后無菌操作取心尖部組織，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15%胰蛋白酶，37 ℃水浴下機(jī)械振蕩、反復(fù)消化，制備細(xì)胞懸液，差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×109/L后接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5% CO2孵箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。

在倒置相差顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)的SD乳大鼠心肌細(xì)胞，多呈不規(guī)則的多角形，少數(shù)有三角形及梭形。生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞在培養(yǎng)介質(zhì)上貼壁較好，邊緣折光率較低。以細(xì)胞免疫熒光檢測生長于蓋玻片的乳大鼠心肌細(xì)胞中的特異性標(biāo)記物α-actin，同時(shí)以Hoechst 33258襯染細(xì)胞核，計(jì)數(shù)α-actin陽性細(xì)胞占總體細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)即為心肌細(xì)胞純度(90%以上)，見圖1。

Figure 1. Morphological observation and identification of neonatal rat cardiomyocytes.A:under laser scanning confocal microcope;B:α-actin immunofluorescence assay and Hoechst 33258 staining.

圖1乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)觀察和鑒定

3實(shí)驗(yàn)分組

取原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前24 h更換無血清DMEM培養(yǎng)基，隨機(jī)分為以下7組：(1)正常對照(control)組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；(2)Ang Ⅱ組：培養(yǎng)液內(nèi)加Ang Ⅱ(10-7mmol/L)，常規(guī)培養(yǎng)48 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(3)TG組：培養(yǎng)液內(nèi)加入TG(50 mmol/L)，常規(guī)培養(yǎng)48 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(4)TM組：培養(yǎng)液內(nèi)加入TM(10 μg/L)，常規(guī)培養(yǎng)72 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)；(5)Ang Ⅱ+Tau組：培養(yǎng)基中加入Tau(40 mmol/L)，余同(2)組；(6)TG+Tau組：培養(yǎng)基中加入Tau(40 mmol/L)，余同(3)組；(7)TM+Tau組：培養(yǎng)基中加入Tau(40 mmol/L)，余同(4)組。

4蛋白質(zhì)合成速率檢測

采用[3H] -亮氨酸摻入技術(shù)測定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24 h，加入3.7×107Bq/L[3H] -亮氨酸孵育24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用預(yù)冷4 ℃ PBS沖洗細(xì)胞2次，吸干廢液，每孔內(nèi)加入250 μL 甲酸，室溫消化30 min后吹勻，全部移入液閃瓶。多功能液閃儀(Packard TRI-CARB 2100TR Liquid Scintillation Analyzer)檢測心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸放射性強(qiáng)度，以每分鐘校正計(jì)數(shù)(corrected counts per minute，ccpm)表示，單位為min-1。同時(shí)按照前述蛋白定量方法測定每組心肌細(xì)胞蛋白含量，以每毫克蛋白的ccpm反映各組蛋白質(zhì)合成速率變化。

5心肌細(xì)胞表面積測定

細(xì)胞以1×104/cm2密度接種于24孔板內(nèi)，以獲得單個(gè)生長培養(yǎng)細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)方法處理細(xì)胞后置于Olympus倒置顯微鏡下采集心肌細(xì)胞圖像，每組中至少采集50個(gè)細(xì)胞，采用Image-Pro Plus 軟件分析各組心肌細(xì)胞表面積。

6RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR測定

采用TRNzol-A+提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA含量，瓊脂糖電泳顯示清晰的18S和28S RNA熒光條帶。按cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各目的基因上、下游引物(P1、P2)見表1。電泳圖像采用Image-Pro Plus 4.1圖像分析軟件分析平均吸光度值，以目的片段和GAPDH的平均吸光度比值反映目的基因的mRNA相對水平。以GAPDH為內(nèi)參照，利用Taqman熒光探針和熒光定量PCR儀(ABI 7500 Fast Real-time PCR System)，采用2-ΔΔCt相對定量法精確定量各目的基因的表達(dá)。

表1 PCR反應(yīng)中目的片段引物

7Westernblotting檢測

按本室報(bào)道方法[8]提取心肌細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，-80℃保存。取上述細(xì)胞蛋白提取液上清 (含蛋白80 μg) 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，10%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉40 min后分別加入CRT、GRP78、PERK、eIF2α多克隆抗體(均為1∶500)、CHOP單克隆抗體 (1∶500) 4 ℃過夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的Ⅱ抗孵育1 h，并以GAPDH (1∶500) 單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，作為上樣對照?？乖?抗體復(fù)合物用ECL法顯示，暗室X光膠片曝光，采用Image-Pro Plus 圖像軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值 (integrated absorbance，IA=平均吸光度值×面積)，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值的比值反映靶蛋白相對水平。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞顯著肥大

1.1心肌細(xì)胞ANP和BNP mRNA表達(dá)的變化 采用RT-PCR檢測心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志蛋白ANP和BNP mRNA表達(dá)改變?nèi)鐖D2。結(jié)果顯示10-7mmol/L AngⅡ、50 mmol/L TG分別作用48 h以及10 μg/L TM作用72 h后心肌細(xì)胞ANP和BNP mRNA表達(dá)均顯著升高。其中10-7mmol/L AngⅡ組ANP和BNP mRNA表達(dá)分別較對照組高147.0%和154.5%(P<0.05)，50 mmol/L TG組分別較對照組高210.1%和142.9%(P<0.05)，10 μg/L TM組分別較對照組高189.0%和284.8%(P<0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺酸明顯抑制AngⅡ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG、TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ANP和BNP表達(dá)上調(diào)，其中AngⅡ+Tau組較AngⅡ組分別低57.5%和38.4%(P<0.05)，TG+Tau組較TG組分低57.1%和31.3%(P<0.05)，TM+Tau組較TM組分別低45.3%和68.3%(P<0.05)。

圖2AngⅡ、ERS誘導(dǎo)劑以及加入?；撬岷髮NP和BNPmRNA表達(dá)的影響

1.2心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的變化 [3H]-亮氨酸摻入技術(shù)檢測心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率變化結(jié)果見圖3。與對照組比較，10-7mmol/L AngⅡ、50 mmol/L TG分別作用48 h以及10 μg/L TM作用72 h后心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率分別較對照組高134.8%、156.6%和136.1%(P<0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬崦黠@抑制AngⅡ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG、TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，其中AngⅡ+Tau組較AngⅡ組蛋白質(zhì)合成速率低32.5%(P<0.05)，TG+Tau組較TG組蛋白質(zhì)合成速率低33.4%(P<0.05)，TM+Tau組較TM組蛋白質(zhì)合成速率低31.1%(P<0.05)。

圖3AngⅡ、ERS誘導(dǎo)劑以及加入?；撬岷髮Φ鞍踪|(zhì)合成速率的影響

1.3心肌細(xì)胞表面積的變化 心肌細(xì)胞表面積測定結(jié)果見圖4。正常對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，10-7mmol/L AngⅡ、50 mmol/L TG分別作用48 h以及10 μg/L TM作用72h后心肌細(xì)胞表面積分別較對照組高99.7%、78.2%和88.0%(P<0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬崦黠@抑制AngⅡ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG、TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增加，其中AngⅡ+Tau組較AngⅡ組表面積低33.0%(P<0.05)，TG+Tau組較TG組蛋白表面積低26.5%(P<0.05)，TM+Tau組較TM組表面積低38.2%(P<0.05)。

2AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞ERS反應(yīng)的影響

2.1CRT、GRP78和CHOP表達(dá) 采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子CRT、GRP78和CHOP mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果見圖5。與對照組比較，10-7mmol/L AngⅡ、50 mmol/L TG分別作用48 h以及10 μg/L TM作用72 h后CRT mRNA表達(dá)分別高146.4%、290.5%和184.5%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別高125.3%、158.6%和105.1%(P<0.05)。上述3組的GRP78 mRNA表達(dá)分別高84.0%、70.8%和98.2%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別高77.6%、48.1%和74.2%(P<0.05)。上述3組的CHOP mRNA表達(dá)分別高117.7%、142.2%和210.4%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別高63.3%、117.2%和122.5%(P<0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺酸明顯抑制AngⅡ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG、TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，與AngⅡ組比較， AngⅡ+Tau組CRT、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)分別低57.6%、60.6%和62.7%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低43.1%、33.3%和37.4%(P<0.05)。TG+Tau組CRT、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)分別較TG組低57.1%、75.9%和61.2%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低54.3%、30.4%和38.2%(P<0.05)。TM+Tau組CRT、GRP78和CHOP mRNA表達(dá)分別較TM組低54.5%、70.4%和74.8%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低30.2%、38.0%和41.0%(P<0.05)。

圖4AngⅡ、ERS誘導(dǎo)劑以及加入?；撬岷髮π募〖?xì)胞表面積的影響

2.2PERK和eIF2α表達(dá) 采用RT-PCR和Western blotting檢測PERK和eIF2α mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果見圖6。與對照組比較，10-7mmol/L AngⅡ、50 mmol/L TG分別作用48 h以及10 μg/L TM作用72 h后PERK mRNA表達(dá)分別高165.4%、131.9%、209.2%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別高132.1%、117.3%、205.1%，P<0.05。上述3組的eIF2α mRNA表達(dá)分別較對照組高110.9%、169.6%、112.0%，P<0.05，蛋白表達(dá)分別高46.5%、82.8%、73.2%，P<0.05。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬崦黠@抑制AngⅡ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG、TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PERK和eIF2α表達(dá)上調(diào)，與AngⅡ組比較，AngⅡ+Tau組PERK和eIF2α mRNA表達(dá)分別低31.7%和56.2%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低43.5%和17.8%(P<0.05)。與TG組比較，TG+Tau組PERK和eIF2α mRNA表達(dá)分別低40.0%和61.0%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低35.9%和45.1%(P<0.05)。與TM組比較，TM+Tau組PERK和eIF2α mRNA表達(dá)分別低38.8%和56.6%(P<0.05)，蛋白表達(dá)分別低44.9%和24.9%(P<0.05)。

圖5AngⅡ、ERS誘導(dǎo)劑以及加入?；撬岷髮RT、GPR78和CHOP表達(dá)的影響

圖6AngⅡ、ERS誘導(dǎo)劑以及加入?；撬岷髮ERK和eIF2α表達(dá)的影響

討 論

心肌肥大的主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、重量及蛋白質(zhì)合成速率增加以及間質(zhì)細(xì)胞增生[9]，并出現(xiàn)ANP和BNP表達(dá)的動態(tài)變化，其中ANP被認(rèn)為是心肌肥大的標(biāo)志分子[10]，而BNP可以預(yù)測心力衰竭發(fā)生，被認(rèn)為是心力衰竭的標(biāo)志分子[11]。本工作在培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大模型上，證實(shí)AngⅡ(10-7mmol/L作用48 h)使心肌細(xì)胞表面積、蛋白質(zhì)合成速率及ANP和BNP表達(dá)均上調(diào)，表明AngⅡ明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

AngⅡ致心肌肥大的機(jī)制尚未完全闡明，近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌肥大發(fā)病機(jī)制中的作用開始受到重視[13]。課題組前期研究結(jié)果顯示，ERS誘導(dǎo)劑TG和TM呈時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生ERS和心肌細(xì)胞肥大，證實(shí)ERS是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要因素[4]。ERS是一種在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞反應(yīng)機(jī)制。適度的ERS有利于增強(qiáng)ER處理未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的能力，促進(jìn)鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)：持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可明顯上調(diào)GPR78和CRT表達(dá)，誘導(dǎo)激活PERK介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，以10-7mmol/L AngⅡ處理心肌細(xì)胞48 h，GRP78和CRT的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，與50 mmol/L TG和10 μg/L TM分別作用48 h和72 h后GRP78和CRT的變化相似，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[17]。提示AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中發(fā)生嚴(yán)重ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬崦黠@抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為GRP78和CRT mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[18]，并消除AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬徇€抑制TG和TM誘導(dǎo)的心肌肥大，表現(xiàn)為ANP和BNP表達(dá)、心肌細(xì)胞表面積減少以及蛋白質(zhì)合成速率降低，上述結(jié)果提示ERS參與了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

PERK是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的重要感受分子，正常狀態(tài)下與GRP78結(jié)合成無活性的復(fù)合物； ERS時(shí)GRP78與未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合后，解離出PERK，使其寡聚化并激活，進(jìn)而磷酸化eIF2α，下調(diào)mRNA和蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，減輕ER蛋白負(fù)荷[19]。持續(xù)激活PERK/eIF2α信號通路將上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，最終引起細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，以10-7mmol/L AngⅡ處理心肌細(xì)胞48 h，PERK、eIF2α和CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，與50 mmol/L TG和10 μg/L TM分別作用48 h和72 h后PERK、eIF2α和CHOP的變化相一致，提示ERS中的PERK/eIF2α信號途徑參與了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大過程，同時(shí)持續(xù)的ERS可能啟動了CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[22]。培養(yǎng)液中加入?；撬岷螅l(fā)現(xiàn)各組中的PERK、eIF2α和CHOP mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，提示?；撬峥赡芡ㄟ^調(diào)控PERK/eIF2α信號途徑的上游靶點(diǎn)抑制PERK激活，從而減輕ERS。上述結(jié)果表明PERK介導(dǎo)的ERS參與了AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

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PERK-mediatedendoplasmicreticulumstressisinvolvedinangiotensinII-inducedmyocardialhypertrophy

Lü Zhen-rong1, WANG Xiao-reng2, LI Yu-zhen2, WANG Chen2, LIU Xiu-hua2

(1DepartmentofPathophysiology,MedicalSchoolofShandongUniversity,Jinan250012,China;2DepartmentofPathophysiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:xiuhualiu98@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)-mediated endoplasmic reticulum stress (ERS) in angiotensin II (AngⅡ) -induced myocardial hypertrophy.METHODSIn the hypertrophy model of AngⅡ-induced cardiomyocytes isolated from neonatal Sprague-Dawley rats, the methods of morphological observation, [3H]-leucine incorporation and surface area measurement were employed to assess the cardiomyocyte hypertrophy. Real-time PCR, RT-PCR and Western blotting were used to detected the expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), calreticulin (CRT), PERK, eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) and C/EBP homologous protein (CHOP) at mRNA and protein levels.RESULTSCompared with control group, Ang II-treated cardiomyocytes showed that the mRNA and protein expression of CRT increased by 146.4% and 125.3%, respectively (P<0.05). The mRNA and protein expression of GRP78 increased by 84.0% and 77.6%, respectively (P<0.05). The mRNA and protein expression of PERK increased by 165.4% and 132.1%, respectively (P<0.05).The mRNA and protein expression of eIF2α was increased by 110.9% and 46.5%, respectively (P<0.05). The mRNA and protein expression of CHOP also increased by 117.7% and 63.3%, respectively (P<0.05).CONCLUSIONPERK-mediated ERS response is involved in AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophy.

Cardiac hypertrophy; Endoplasmic reticulum stress; Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.001