實(shí)現(xiàn)人源FGF－21高效可溶性表達(dá)的兩種策略

李 娟， 劉 雯， 肖 磊， 勞 勛， 趙麗芬， 黃 靜， 吳自榮

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

0 引 言

成纖維生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF－21）是FGF家族新成員，屬于FGF19亞族，與FGF19同源性達(dá)35%，主要存在于哺乳動(dòng)物的肝組織、骨骼肌組織以及胸腺組織中［1，2］.FGF－21的重要生理功能包括調(diào)節(jié)脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)機(jī)體血糖［3］，提高胰腺β細(xì)胞的存活率，改善β細(xì)胞的功能［4］，抵制肥胖，加速能量消耗［5］，而且尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生低血糖、體重增加等［5］副作用，因此在2型糖尿病治療中有良好的應(yīng)用前景.

根據(jù)國(guó)外 Kharitonenkov［3］和國(guó)內(nèi)姜媛媛［6］等人的文獻(xiàn)報(bào)道，人源FGF－21在大腸桿菌中可溶性差，常以包涵體表達(dá)，為后續(xù)研究帶來不便.分子伴侶能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊，提高蛋白的可溶性.沈繼紅等［7］使用4種分子伴侶蛋白實(shí)現(xiàn)低溫脂肪酶Lip－837可溶性表達(dá)，Arayo Haga等［8］利用分子伴侶質(zhì)粒pTf16表達(dá)了可溶性人源自分泌運(yùn)動(dòng)因子Autotaxin.本文采用引入分子伴侶Tig協(xié)助蛋白折疊的方法以期實(shí)現(xiàn)FGF－21高效可溶性表達(dá).

在pET表達(dá)系統(tǒng)中，通常采用非代謝性乳糖類似物異丙基－β－D－巰基半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo).IPTG雖能夠誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，但其本身對(duì)于細(xì)胞有一定的毒害作用，影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng)［9］.20世紀(jì)80年代Coffey等［10，11］利用自誘導(dǎo)方法在人角化細(xì)胞中獲得了大量TGF－α蛋白.美國(guó)布魯克黑文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Studier［12］和他的小組成員們不斷地摸索探究，總結(jié)出自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，并且在如Ding Y［13］高效表達(dá)TAP堿性磷酸酶、顧娟［9］表達(dá)的胰高血糖素樣肽－1突變體（mGLP－1）等實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí).自誘導(dǎo)發(fā)酵的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，但目前該系統(tǒng)的應(yīng)用研究較少.本研究擬考察在大腸桿菌中自誘導(dǎo)表達(dá)FGF－21融合蛋白的可行性，以提高蛋白產(chǎn)量.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和質(zhì)粒pET32a（＋）均為本實(shí)驗(yàn)室保藏.

質(zhì)粒pDONR223－FGF－21購(gòu)于上海英基生物科技有限公司.質(zhì)粒pTf16由上海生物制品研究所提供.

1.1.2 主要試劑及儀器

工具酶，Takara公司；BCA蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒，上海博彩生物科技有限公司；Mini－ProteinII型聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽（Bio－rad公司）；血糖測(cè)試儀，上海新立醫(yī)療器械有限公司.

1.1.3 乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基

胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.5%，甘油0.5%，葡萄糖0.05%，乳糖0.2%，Na2HPO450 mmol／L，KH2PO450 mmol／L，（NH4）2SO425 mmol／L，MgSO42 mmol／L.

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性健康C57BL／6小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007－0005.

1.2 方法

1.2.1 重組載體pET32a（＋）－FGF－21的構(gòu)建

利用Clone Manager生物軟件，根據(jù)FGF－21 cDNA序列設(shè)計(jì)上游引物P1和下游引物P2.上下游引物的5′端分別引入酶切位點(diǎn)BglⅡ和EcoRⅠ.引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：

P1 5′－GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC－3′，BglⅡ；

P2 5′－ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG－3′，EcoRⅠ.

以質(zhì)粒pDONR223－FGF－21為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng).將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a（＋）用限制性內(nèi)切酶BglⅡ／EcoRⅠ酶切，分別回收大片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中.提取重組質(zhì)粒，用BglⅡ／EcoRⅠ雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序.

1.2.2 FGF－21融合蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將含有分子伴侶Tig基因的質(zhì)粒pTf16和測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET32a（＋）－FGF－21分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中.挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、210 r／min培養(yǎng)12 h.將培養(yǎng)12 h的菌液按1%的比例轉(zhuǎn)接入乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，27℃、210 r／min培養(yǎng)16 h，離心收集菌體.

取少量菌液進(jìn)行菌密度檢測(cè)，同時(shí)收集菌體進(jìn)行超聲破碎，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE電泳.目的蛋白在上清中表明融合蛋白為可溶性表達(dá)，若在沉淀中表明其為包涵體.

剩余菌體重懸于IDA0（20 mmol／L Tris－HCl pH7.4，0.5 mol／L NaCl）中，超聲破碎并收集上清.上清經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，收集各洗脫組分，用SDS－PAGE檢測(cè)融合蛋白所在組分，將對(duì)應(yīng)洗脫液超濾濃縮并脫鹽，得到融合蛋白.

1.2.3 凝膠成像分析

通過天能凝膠成像系統(tǒng)獲得凝膠圖譜，用軟件ImageJ對(duì)凝膠圖譜上的蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描半定量分析，計(jì)算融合蛋白總表達(dá)量和可溶性融合蛋白的比例.融合蛋白總表達(dá)量通過計(jì)算融合蛋白TrxA－FGF－21占全菌總蛋白的百分比而得，可溶性融合蛋白的比例＝上清中融合蛋白TrxA－FGF－21／（上清融合蛋白 TrxA－FGF－21＋沉淀融合蛋白 TrxA－FGF－21）×100%.總可溶性蛋白相對(duì)產(chǎn)量＝表達(dá)量（%）×可溶性（%）×菌體密度OD600.

1.2.4 FGF－21蛋白的純化

腸激酶酶解TrxA－FGF－21融合蛋白，30℃裂解10～16 h，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行鎳離子親和層析，收集含F(xiàn)GF－21的組分，用截留分子量為10 kD的Millipore Amicon Ultra－15超濾管將蛋白脫鹽并濃縮，得到重組蛋白FGF－21.BCA法測(cè)定蛋白含量.

1.2.5 FGF－21的降血糖活性檢測(cè)

雄性健康C57BL／6小鼠分為2組（n＝6）.A組為生理鹽水對(duì)照組；B組為給藥組.

連續(xù)注射7 d FGF－21，于第7天進(jìn)行小鼠口服糖耐量（OGTT）實(shí)驗(yàn).糖耐量實(shí)驗(yàn)是在小鼠禁食16 h后，于第7天早上測(cè)基礎(chǔ)血糖，然后按0.5 mg／kg皮下注射FGF－21，對(duì)照組注射0.9%NaCl溶液.1 h后，對(duì)小鼠（4 g／kg）進(jìn)行口服50%葡萄糖，此時(shí)計(jì)為0時(shí)刻，再分別于第15、30、45、60、75、90和105 min進(jìn)行小鼠尾靜脈取血，測(cè)定血糖濃度，以檢測(cè)FGF－21的降血糖活性.

1.2.6 FGF－21對(duì)脂代謝的影響

雄性健康C57BL／6小鼠分為2組（n＝6）.A組為生理鹽水對(duì)照組；B組為給藥組.

連續(xù)注射28 d FGF－21，于第29天對(duì)小鼠眼球采血，血樣4℃放置30～60 min后，4 000r／min離心10 min，取血清，委托德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司測(cè)定血清中甘油三酯水平.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±SD），并用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 FGF－21表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析

重組質(zhì)粒pET32a（＋）－FGF－21進(jìn)行BglⅡ／EcoRⅠ雙酶切和PCR鑒定，雙酶切后大、小片段位置與理論值相符.PCR鑒定所得目的片段約578 bp，與FGF－21基因片段大小一致（見圖1）.將該陽(yáng)性克隆委托上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確.

圖1 重組質(zhì)粒pET32a（＋）－FGF－21的雙酶切鑒定和PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant pET32a（＋）－FGF－21 plasmid by BglⅡ／EcoRⅠdouble enzymy digestion and PCR

2.2 融合蛋白TrxA－FGF－21的誘導(dǎo)表達(dá)

基因工程菌株pET32a（＋）－FGF－21／BL21（DE3）經(jīng)0.1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)，融合蛋白表達(dá)量為15.6%，可溶性僅為34.7%（見圖2）.0.1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)16 h，OD600達(dá)到1.84，融合蛋白 TrxA－FGF－21表達(dá)量為17.5%，可溶性達(dá)到92.4%.在分子伴侶協(xié)同表達(dá)下，TrxA－FGF－21融合蛋白的可溶性大大提高（見圖3）.

圖2 pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Expression of pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by IPTG induction

－

－

圖3 pTf16和pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Expressions of pTf16 and pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by IPTG induction

利用乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)菌株pET32a（＋）－FGF－21／pTf16／BL21（DE3），并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行可溶性鑒定（見圖4）.結(jié)果顯示經(jīng)乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h后，TrxA－FGF－21融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白約17.4%左右，菌體OD600達(dá)到了12.4，且可溶性達(dá)到76.1%（見表1）.

圖4 pTf16和pET32a（＋）－FGF－21在BL21（DE3）的乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Expressions of pTf16 and pET32a（＋）－FGF－21 in BL21（DE3）by Lactose auto－induction

由表1可知采用乳糖自誘導(dǎo)策略，融合蛋白TrxA－FGF－21的可溶性雖只有76.1%，但菌體生物量達(dá)到12.4.因此，總的可溶性TrxA－FGF－21表達(dá)產(chǎn)量較IPTG誘導(dǎo)的高，按公式：相對(duì)產(chǎn)量＝表達(dá)量（%）×可溶性（%）×菌體密度OD600，可知IPTG誘導(dǎo)的可溶性TrxA－FGF－21相對(duì)產(chǎn)量為0.30，乳糖自誘導(dǎo)的的可溶性TrxA－FGF－21相對(duì)產(chǎn)量為1.64，乳糖自誘導(dǎo)的可溶性TrxA－FGF－21產(chǎn)量是IPTG誘導(dǎo)的5.5倍.

表1 IPTG誘導(dǎo)與乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)FGF－21融合蛋白的比較Tab.1 Comparison of expression TrxA－FGF－21 fusion protein by IPTG and Lactose auto－induction

2.3 融合蛋白TrxA－FGF－21的Western blotting鑒定

利用FGF－21單克隆抗體對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果表明在全菌液和上清的泳道中約39 kD處有明顯的識(shí)別條帶，即為TrxA－FGF－21融合蛋白（見圖5）.

圖5 TrxA－FGF－21融合蛋白 Western Blotting鑒定Fig.5 Identification of TrxA－FGF－21 fusion protein by Western Blotting

2.4 FGF－21的降血糖活性檢測(cè)

純化后FGF－21在C57BL／6小鼠體內(nèi)進(jìn)行降血糖活性測(cè)定.

FGF－21給藥組在45、60和75 min，均能明顯降低小鼠血糖，與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），糖耐量得到改善（見圖6）.說明本研究方法制備的重組FGF－21蛋白具有降低小鼠血糖的生物學(xué)活性.

2.5 FGF－21對(duì)脂代謝的影響

對(duì)小鼠連續(xù)28 d注射FGF－21后，取其血清測(cè)定甘油三酯水平，結(jié)果表明，給藥組能明顯降低小鼠甘油三酯水平，與對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.01）（見圖7）.說明FGF－21參與了脂代謝的調(diào)節(jié)，可能通過提高脂肪組織中脂肪酶的表達(dá)，促進(jìn)脂肪的分解和生酮作用的發(fā)生而降低甘油三酯.

圖6 FGF－21在C57BL／6小鼠體內(nèi)活性測(cè)定Fig.6 Determination of activity on mice

圖7 FGF－21對(duì)C57BL／6小鼠甘油三酯水平影響Fig.7 Effects of FGF－21Triglyceride levels on mice

3 討 論

利用基因工程能夠較快地制備重組蛋白，人源FGF－21在大腸桿菌中主要是以包涵體形式表達(dá)［3，6］，難以獲得高效穩(wěn)定的可溶性蛋白.本文利用在線軟件（http：／／www.biotech.ou.edu）對(duì)FGF－21在大腸桿菌中的可溶性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF－21在大腸桿菌中表達(dá)不可溶性達(dá)到86.2%.于是將FGF－21與硫氧還蛋白A（Thioredoxin A，TrxA）融合表達(dá)，通過TrxA提高FGF－21的可溶性.根據(jù)pET32a（＋）的結(jié)構(gòu)，將FGF－21基因序列連接在TrxA序列下游合適的位置，利用同樣的在線軟件對(duì)該融合蛋白可溶性進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，加入TrxA后，融合蛋白的可溶性比之前提高，但不可溶性還是達(dá)到65.9%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，融合蛋白主要以包涵體形式存在.

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分子伴侶能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)進(jìn)行正確折疊，獲得正確的構(gòu)型，增強(qiáng)其可溶性等［14］.本研究共轉(zhuǎn)化含有分子伴侶Tig基因的質(zhì)粒pTf16和重組質(zhì)粒pET32（＋）a－FGF－21于大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，該分子伴侶pTf16質(zhì)粒的啟動(dòng)子為araB，可以阿拉伯糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)分子伴侶Tig的表達(dá)，同時(shí)帶有氯霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記.結(jié)果顯示，經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)，分子伴侶Tig表達(dá)，并能協(xié)助FGF－21正確折疊，表達(dá)的FGF－21融合蛋白主要以可溶性形式存在，在IPTG誘導(dǎo)下，F(xiàn)GF－21融合蛋白的可溶性高達(dá)92.4%.由于分子伴侶本身是獨(dú)立表達(dá)的，在對(duì)目的蛋白純化的過程中，不需要采用額外的方法來去除分子伴侶蛋白，因此采用本策略在大腸桿菌中表達(dá)難溶性蛋白簡(jiǎn)便、快捷.

另外，在基因工程表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，人們常選用pET系統(tǒng)的質(zhì)粒，因其含有l(wèi)acI表達(dá)元件，蛋白的表達(dá)需要用IPTG誘導(dǎo)，一定濃度的IPTG會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性，直接影響目的蛋白的產(chǎn)量.因此，本研究的另一個(gè)策略采用乳糖自誘導(dǎo)的方式來提高目的蛋白的產(chǎn)量.在相同影響因素下，本文比較了乳糖自誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量及產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)量差異雖不大，但是乳糖自誘導(dǎo)所獲得的菌體密度遠(yuǎn)高于IPTG誘導(dǎo)，約為IPTG誘導(dǎo)的6～7倍，因此，采用乳糖自誘導(dǎo)策略可通過提高生物量來獲得更高產(chǎn)量的目的蛋白.

綜上所述，分子伴侶協(xié)助蛋白表達(dá)的方法及乳糖自誘導(dǎo)的策略實(shí)現(xiàn)了人源FGF－21在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)，且用此方法獲得的重組FGF－21在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)生物學(xué)活性，這為基因工程表達(dá)難溶性蛋白以及新型治療2型糖尿病藥物FGF－21的研究奠定了一定的基礎(chǔ).

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