肌醇需求酶1（IRE1）激酶抑制劑高通量篩選模型的建立

張坤智， 蘇明波，， 周宇波

（1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2.國(guó)家新藥篩選中心，上海 201203）

0 引 言

IRE1是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的單次跨膜蛋白，具有絲氨酸／蘇氨酸激酶和核酸酶雙重功能，是未折疊蛋白應(yīng)答（UPR，unfolded protein response）中進(jìn)化最保守、最重要的通路［1］.IRE1蛋白一方面可以感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，使激酶區(qū)域自磷酸化進(jìn)而激活核酸酶活性，在mRNA水平上剪切其下游轉(zhuǎn)錄因子XBP1［2］.另一方面，激活的IRE1還可以通過不依賴于XBP1的途徑，招募JNK，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡［3］.

IRE1作為激酶／核酸酶雙功能酶，其激酶與核酸酶之間的關(guān)系為人們所關(guān)注.有的研究認(rèn)為IRE1激酶自身磷酸化對(duì)IRE1核酸酶的活性是必需的［4］；有研究認(rèn)為IRE1核酸酶活性與激酶活性的有無之間沒有必然聯(lián)系［5］，還有一些研究認(rèn)為抑制IRE1激酶的活性反倒能夠激活其核酸酶活性［6］.到底IRE1激酶與核酸酶之間有怎樣的聯(lián)系，尚不甚清楚.

IRE1參與調(diào)解機(jī)體的許多生理功能，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝等諸多生命活動(dòng)中起著很重要的作用.活化的IRE1參與胰高血糖素對(duì)肝臟多種代謝途徑的調(diào)節(jié)，抑制IRE1通路則顯著改善血糖水平并提高機(jī)體的葡萄糖耐受能力［7］，整個(gè)過程與XBP1無關(guān)，提示IRE1激酶活性可能參與這一調(diào)控.最新的報(bào)道則指出IRE1依賴于其激酶活性促進(jìn)突變型亨廷頓蛋白的積累，從而加重亨廷頓舞蹈癥［8］.IRE1在腫瘤低氧、低糖的微環(huán)境中促進(jìn)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，擴(kuò)張腫瘤血管使得惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤能持續(xù)生長(zhǎng)［9，10］.但這一過程究竟是IRE1激酶還是IRE1核酸酶發(fā)揮作用，尚不清楚.

基于以上所述，IRE1不僅具有重要的生理功能，而且與包括代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等重大疾病有著密切關(guān)系，但目前在IRE1化學(xué)生物學(xué)方面的研究工作特別是IRE1激酶抑制劑研究還非常少，極大程度的限制了進(jìn)一步準(zhǔn)確理解IRE1生理功能及其與疾病的關(guān)系研究.IRE1激酶小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)，不僅對(duì)驗(yàn)證IRE1激酶活性與疾病關(guān)系及潛在的藥物發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)理提供研究思路與平臺(tái)，也對(duì)闡明激酶與核酸酶之間的關(guān)系也提供了研究工具.本項(xiàng)目擬從IRE1激酶活性調(diào)控入手，建立體外的IRE1激酶抑制劑高通量篩選模型，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IRE1激酶抑制劑奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質(zhì)粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP（Genbank Number：NM＿001433.3）購(gòu)自 Addgene公司，pFAST－Bac1來自本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌JM109和DH5α來自本實(shí)驗(yàn)室保存，各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶以及PCR試劑為Takara公司產(chǎn)品，PCR回收以及膠回收試劑盒為Axygene產(chǎn)品，PCR管購(gòu)自Promega公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司、OMEGA公司以及Nucleobond公司，Sf9和Hi－5細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin購(gòu)自Invitrogen公司，Bluo－gal IPTG，GIBCO Grace昆蟲培養(yǎng)基，Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，GIBCO胎牛血清，sf－900ⅡSFM昆蟲培養(yǎng)基均購(gòu)自Invitrogen公司，HTRF試劑盒購(gòu)自Cisbio公司，白色384圓孔板購(gòu)于PE公司，星形孢菌素（sc－3510A）購(gòu)于Santa Cruz公司，顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品，型號(hào)：IX51，呈像系統(tǒng)為Image－Pro Plus AMS.

1.2 儀器

測(cè)序由博尚公司完成，PCR儀購(gòu)自PERKIN ELMER公司，NANO Drop 1000購(gòu)自Thermo公司，搖床購(gòu)自Forma Scientific公司，由分光光度儀購(gòu)自Pharmacia Biotech公司，水浴鍋為精宏公司產(chǎn)品，常溫離心機(jī)為Thermo公司產(chǎn)品，4℃離心機(jī)購(gòu)自eppendorf公司，4℃高速大型離心機(jī)購(gòu)自HITACH公司，超聲破胞儀購(gòu)自寧波科生儀器廠，KARMA NiSepharose 6FF購(gòu)自業(yè)力生物，Envision購(gòu)自Perkin Elemer公司，機(jī)器加樣器為Beckman公司出品.

1.3 重組基因的構(gòu)建

1.3.1 目的基因的擴(kuò)增

以質(zhì)粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP為模板，上游引物：AATTGAATTCCCATGATCACCTATCCCCTGAGCATGCA；下游引物：TATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGAGGGCGTCTGGAGTCACTGG；在上下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切切點(diǎn)，同時(shí)在下游引物中引入了6×His標(biāo)簽.引物由上海生工生物工程公司合成.PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，56℃變性30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min.

PCR擴(kuò)增模板的1 384位到2 931位［11］，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè).

1.3.2 目的基因的酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及克隆鑒定

參照Invitrogen公司網(wǎng)站提供的Bac－to－bac TOPO Expression System說明書，將目的基因經(jīng)特異性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后連接到pFAST－Bac1質(zhì)粒載體上，測(cè)序無誤后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株，抽提出IRE1－pFAST－Bac1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DH10BacTM菌株中，在含有通過慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X－gal和IPTG的平板上培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑出白斑，提取質(zhì)粒，引入M13引物通過PCR方法分析產(chǎn)物的長(zhǎng)度來檢驗(yàn)?zāi)康钠问欠癯晒Σ迦耄?2］.PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，56℃變性30 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min.

1.4 昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)

在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf－900Ⅱ中加入青霉素50 kU／L、鏈霉素50 mg／L以及10%的胎牛血清，在無CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞三代至穩(wěn)定，才可用于桿狀病毒復(fù)制.

在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基GIBCO GRACE中加入青霉素50 kU／L、鏈霉素50 mg／L、2.5%的胎牛血清和18 mmol／L的Glutamin，在無CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hi－5細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞3代至穩(wěn)定，才可用于桿狀病毒侵染和重組蛋白的表達(dá).

1.5 重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞、重組桿狀病毒的包裝和獲得以及重組桿狀病毒侵染Hi－5細(xì)胞

當(dāng)Sf9細(xì)胞長(zhǎng)至密度約80%且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，按照CellFectin（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將重組的桿粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中.3 d后觀察到Sf9細(xì)胞核內(nèi)容物變多，核變大，核折光性增強(qiáng)、細(xì)胞貼壁不牢等現(xiàn)象時(shí)，將細(xì)胞吹打下來，并轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r／min×3 min離心，收取上清為第一代重組桿狀病毒，用于進(jìn)一步感染Sf9細(xì)胞并擴(kuò)增病毒.

當(dāng)Hi－5細(xì)胞在直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至密度大于80%時(shí)，將擴(kuò)增的病毒感染Hi－5細(xì)胞，當(dāng)Hi－5細(xì)胞出現(xiàn)核變大，貼壁不牢并成團(tuán)漂浮起來等現(xiàn)象時(shí)，將細(xì)胞吹打下來，轉(zhuǎn)移到30 mL離菌管中，4℃離心，6 000 r／min×5 min，收集細(xì)胞.

1.6 目的蛋白hIRE1α（462 aa—977 aa）［11］的表達(dá)純化

hIRE1α胞內(nèi)段含有激酶以及核酸酶結(jié)構(gòu)域，選取462位至977位的氨基酸，包含了激酶、核酸酶結(jié)構(gòu)域以及一部分跨膜區(qū)段.

上一步收集的細(xì)胞用4℃預(yù)冷的裂解緩沖液（25 mmol／LTris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1%Triton－X100，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）重懸；后置于冰上，超聲裂解（超聲1 s，間隔1 s，強(qiáng)度45%，時(shí)間120 s，超聲裂解至鏡下觀察無明顯的團(tuán)狀細(xì)胞）；4℃，12 000 r／min×15 min，離心至管壁上沒有白色物質(zhì)沉積，收集上清.

取1 mL Ni－beads，4℃，1 000 r／min×1 min離心，棄去上清，用平衡緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）重懸beads，4℃，1 000 r／min×1 min離心，棄去上清；取裂解步驟中收集到的上清，與平衡過的beads混合，4℃搖晃輕柔孵育2 h.

孵育后的的上清倒于5 mL管柱，穿透（flowthrough）流出，beads連同結(jié)合的蛋白沉在管柱底部.用5 mL含0mmol／L 咪唑的緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油）緩慢潤(rùn)洗beads，后用含50 mmol／L咪唑的除雜緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇，50 mmol／L 咪唑）緩慢潤(rùn)洗beads，不斷吸取20μL流出的液體滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的180μL G250中，至G250不顯示藍(lán)色，則認(rèn)為雜蛋白清除干凈.

雜蛋白清除干凈后，每次用500μL含250 mmol／L咪唑的洗脫緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘 油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇，250 mmol／L咪唑）洗脫目的蛋白，間斷吸取20μL流出的蛋白液體滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的180μL G250中，至G250不顯示藍(lán)色，則認(rèn)為目的蛋白已洗脫盡.

預(yù)先準(zhǔn)備好脫鹽緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）置于4℃預(yù)冷，蛋白置于脫鹽緩沖液中，4℃輕柔旋轉(zhuǎn)過夜以達(dá)到去除咪唑的目的.透析脫鹽后的蛋白，測(cè)定濃度之后，分裝并凍存于－80℃.

上清、沉淀、目的蛋白、Flowthrough、雜蛋白以及目的蛋白與2×loading buffer等體積混合，100℃煮樣10 min，用以聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測(cè).

1.7 目的蛋白活性的檢測(cè)

采用HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence）激酶測(cè)活方法.在 HTRF試劑盒中，S2是一段含有磷酸化位點(diǎn)的肽段，可被IRE1激酶識(shí)別并磷酸化.參照試劑盒推薦的反應(yīng)時(shí)間，底物與蛋白30℃孵育1 h，加入抗體和染料，30℃孵育1 h后，熒光檢測(cè)儀Envision在405 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，檢測(cè)620 nm和665 nm的兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)下產(chǎn)物的熒光信號(hào)，并通過兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)下熒光信號(hào)的比值來判定酶活性的強(qiáng)弱.同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照來判定酶活性的有無以及強(qiáng)弱.

1.8 IRE1激酶抑制劑高通量篩選體系的建立

1.8.1 酶、底物以及DMSO濃度的確定

依照激酶測(cè)活HTRF法，底物S2濃度暫定為800 nmol／L，ATP暫定為50μmol／L，酶自最高濃度逐步稀釋，同時(shí)設(shè)置酶的空白對(duì)照.根據(jù)熒光讀值，繪制酶促反應(yīng)曲線，綜合考慮酶和空白對(duì)照的窗口值以及反應(yīng)速度的線性范圍，來確定酶促反應(yīng)的合適酶濃度.

眾所周知，Km即是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度.因?yàn)楸疚牡姆磻?yīng)是S2與ATP雙底物，故測(cè)定一個(gè)底物的Km值時(shí)，需先使另一種底物過量，然后做出相應(yīng)底物的不同濃度對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速度（即HTRF signal），通過回歸計(jì)算，最終獲得最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，即Km值.

在上述酶與底物合適的濃度下，檢測(cè)DMSO濃度對(duì)于酶活性的影響.

1.8.2 高通量篩選體系的評(píng)價(jià)

在白色384圓孔板中評(píng)價(jià)篩選體系是否符合高通量篩選的要求.陰性對(duì)照為之前一步確定的各種組分，陽(yáng)性對(duì)照是在陰性對(duì)照的組分中加入100 nmol／L的星型孢菌素（STS，staurosporine，廣譜的激酶抑制劑）.陽(yáng)性、陰性對(duì)照各占板面積的1／2.

Z′因子是被廣泛用于評(píng)價(jià)高通量篩選體系是否合格的的參數(shù)指標(biāo)，用來評(píng)估反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的［13］.根據(jù)公式：Z′因子＝1－3（SDneg＋SDpos）／（Mneg－Mpos），其中SDneg和Mneg分別代表陰性對(duì)照相對(duì)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值；SDpos和Mpos分別代表陰性對(duì)照相對(duì)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值.

CV（變異系數(shù)，coefficient of variation），是標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值之比，用百分?jǐn)?shù)表示，即CV＝SD／mean×100%，用以衡量篩選體系的相對(duì)偏差.

1.8.3 廣譜的激酶抑制劑星型孢菌素在高通量篩選模型上的評(píng)價(jià)

星型孢菌素（STS）是ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，廣泛抑制激酶的活性，在確定的高通量篩選酶促反應(yīng)體系中評(píng)價(jià)STS是否有抑制作用.

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增以及IRE1－pFAST－Bac1重組質(zhì)粒的制備

從IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP質(zhì)粒中擴(kuò)增目基因.hIRE1α（nt 1384—nt 2931）共有1 548個(gè)堿基，加上前后引物共有1 638個(gè)堿基.對(duì)比marker，PCR擴(kuò)增如出現(xiàn)大小接近，且單一濃密的條帶即證明擴(kuò)增成功（見圖1）.

圖1 人源IRE1α（nt 1384—nt 2931）基因片段擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果Fig.1 Results of PCR fragment of hIRE1α（nt 1384—nt 2931）detected by agarose electrophoresis

上一步擴(kuò)增出的目的基因經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，挑單克隆，抽取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒IRE1－pFAST－Bac1經(jīng)雙向測(cè)序無誤后，轉(zhuǎn)化到DH10BacTM菌株中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑出白斑，提取質(zhì)粒，采用引物M13，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若目的基因成功插入則能擴(kuò)增出大小小約2 100 bp的條帶，包含約1 600 bp的目的基因和約500 bp的載體片段；反之，則未能得到重組桿粒.結(jié)果顯示，約2 100 bp處有清晰的條帶，說明重組桿粒（命名為BacMid－IRE1）成功制備（見圖2）.

圖2 BacMid－IRE1質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.2 Results of BacMid－IRE1 detected by agarose electrophoresis

2.2 重組桿粒對(duì)Sf9和hi－5細(xì)胞的感染

未經(jīng)重組桿粒感染的對(duì)照組Sf9細(xì)胞貼壁牢固（見圖3A），而感染了重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞直徑增加，核變大，核內(nèi)容物變多，細(xì)胞貼壁不牢時(shí)（見圖3B），離心收取病毒用以后續(xù)病毒侵染.圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度代表50μm.

重組的桿狀病毒進(jìn)一步侵染Hi－5細(xì)胞，與未經(jīng)重組桿狀病毒侵染的對(duì)照組相比（見圖4A），當(dāng)細(xì)胞直徑增大，細(xì)胞核內(nèi)容物明顯變多變雜，細(xì)胞也有明顯的脫落時(shí)（見圖4B），離心收取細(xì)胞用于表達(dá)純化.圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度代表100μm.

圖3 正常狀態(tài)下的Sf9細(xì)胞（A）和受重組桿狀病毒侵染72 h之后的Sf9細(xì)胞（B）Fig.3 Uninfected Sf9（A）cells and Sf9 cells infected with recombinant baculovirus（B）

2.3 目的蛋白hIRE1α（462aa—977aa）的獲得

將經(jīng)過Ni－Beads純化的hIRE1α（462 aa—977aa）經(jīng)過SDS－PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示：SDS－PAGE膠圖經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色之后，55 kD出呈現(xiàn)清晰且單一的條帶，大小與預(yù)期（56 kD）相符，表明hIRE1α（462 aa—977aa）在昆蟲細(xì)胞中獲得正確的表達(dá)（見圖5）.因?yàn)橛兄w積的殘留，圖5中l(wèi)ane 6為除雜后用250 nmol／L咪唑第一次洗脫下的蛋白，可見雜蛋白并未完全除凈，lane 7—8為250 nmol／L咪唑后續(xù)洗脫下的蛋白，可見雜蛋白已基本除凈.

圖4 正常狀態(tài)下的Hi－5細(xì)胞（A）和受重組桿狀病毒侵染72 h之后的Hi－5細(xì)胞（B）Fig.4 Uninfected Hi－5（A）cells and Hi－5 cells infected with recombinant baculovirus（B）

圖5 SDS－PAGE分析純化的hIRE1α蛋白（462aa—977aa）Fig.5 The purified hIRE1αprotein（462aa—977aa）analyzed by SDS－PAGE

純化的hIRE1α經(jīng)測(cè)定，濃度測(cè)定為125μg／mL（約為2μmol／L）；SDS－PAGE結(jié)果經(jīng)凝膠薄層掃描鑒定純化的hIRE1α蛋白純度約為85%.

2.4 IRE1激酶抑制劑高通量篩選體系的確定

底物S2濃度暫定為800 nmol／L，ATP暫定為50μmol／L，酶自最高濃度逐步稀釋，同時(shí)設(shè)置酶的空白對(duì)照，選取酶促反應(yīng)在線性范圍內(nèi)且窗口合適的酶濃度，根據(jù)酶活性曲線，選取了25 nmol／L作為合適的酶濃度.與空白對(duì)照相比，窗口值約為15倍（見圖6）.

確定酶濃度為25 nmol／L，設(shè)定底物ATP濃度為200μmol／L使其在酶促反應(yīng)中飽和，逐步稀釋底物S2，通過回歸計(jì)算，得出底物S2的Km值為300 nmol／L（見圖7）.

確定底物S2的的濃度為300 nmol／L，選擇其濃度為2μmol／L使其在酶促反應(yīng)中飽和，逐步稀釋底物ATP，通過回歸計(jì)算，得出底物ATP的Km值為16μmol／L（見圖8）.

圖6 不同濃度的IRE1激酶活性Fig.6 Kinase activity of different concentrations of IRE1

圖7 不同濃度的底物S2對(duì)IRE1激酶催化反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of concentrations of S2on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

圖8 不同濃度的ATP對(duì)IRE1激酶催化反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of concentrations of ATP on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

過高的DMSO會(huì)對(duì)IRE1激酶活性產(chǎn)生影響，考察了4%、2%、1%和0%4個(gè)DMSO濃度（見圖9），發(fā)現(xiàn)4%的DMSO濃度已經(jīng)對(duì)IRE1激酶活性產(chǎn)生了20%的抑制；此外化合物溶解在DMSO中，隨著DMSO濃度的降低，化合物的溶解性也會(huì)降低.綜合兩方面的因素，選擇2%DMSO作為篩選條件.

2.5 高通量篩選模型的檢測(cè)和陽(yáng)性抑制劑的評(píng)價(jià)

用Z′因子和CV值來檢測(cè)高通量篩選模型是否合格.一般認(rèn)為，當(dāng)Z′因子的值大于0.5且CV值小于10%時(shí)，才能高通量進(jìn)行篩選.本模型Z′因子等于0.58，CV值等于7.5%，故認(rèn)為本優(yōu)化條件符合高通量篩選要求.

圖9 不同濃度的DMSO對(duì)IRE1激酶催化反應(yīng)的影響Fig.9 IRE1 kinase activity in different concentrations of DMSO

星型孢菌素是激酶的廣譜性抑制劑，本文在本模型上檢測(cè)了其對(duì)激酶的抑制作用，并且測(cè)得其IC50＝（13.83±3.9）nmol／L，與文獻(xiàn)報(bào)道的（13±8.4）nmol／L相近［14］（見圖10）.

圖10 星型孢菌素抑制IRE1激酶活性的IC50＝（13.83±3.9）nmol／LFig.10 Concentration－dependent inhibition of IRE1 kinase activity by Staurosporine（IC50＝（13.83±3.9）nmol／L）

3 討 論

體外分子水平實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｓ糜卺槍?duì)單靶點(diǎn)的藥物發(fā)現(xiàn)，因其較容易進(jìn)行高通量的篩選，近年來，分子篩選模型針對(duì)小分子抑調(diào)節(jié)劑劑的篩選被廣泛用于新藥發(fā)現(xiàn).IRE1分子量較大，翻譯后修飾較復(fù)雜，而昆蟲表達(dá)系統(tǒng)具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，更適用于高通量篩選，故選用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá).結(jié)合Bac－to－Bac桿狀病毒系統(tǒng)，成功構(gòu)建出桿狀病毒的穿梭質(zhì)粒并獲得了高純度的IRE1蛋白（見圖3）.同時(shí)，相對(duì)于文獻(xiàn)，引入His標(biāo)簽使得蛋白純化更為簡(jiǎn)便快捷.

藥物篩選是新藥發(fā)現(xiàn)的最初階段，高通量藥物篩選具有速度快、效率高、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn).實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分樣品具有激活I(lǐng)RE1激酶的作用，將本篩選模型適當(dāng)改進(jìn)也可作為IRE1激酶激活劑的篩選模型進(jìn)行使用.

HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence），結(jié) 合 了 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF，Time Resolved Fluorescence）是近年來公認(rèn)并廣泛用于檢測(cè)蛋白分子激酶活性的一項(xiàng)成熟的技術(shù)［15］，HTRF技術(shù)以熒光信號(hào)取代了同位素信號(hào)，能較準(zhǔn)確反映出激酶的活性.本研究采用HTRF技術(shù)測(cè)定IRE1激酶和化合物的相互作用，建立高通量的IRE1激酶抑制劑篩選模型，為相關(guān)的基礎(chǔ)研究和新藥發(fā)現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).除了HTRF法之外，目前廣泛使用的激酶測(cè)活方法還有 ADP－GLO［16］、Z′－LYTE［17］以及P32等方法.其中 ADP－GLO的測(cè)活原理是：激酶反應(yīng)過程中消耗ATP產(chǎn)生ADP，激酶反應(yīng)終止后，加入與酶促反應(yīng)等體積的ADPGLO將反應(yīng)產(chǎn)生的ADP轉(zhuǎn)化為ATP，這些ATP被熒光素酶轉(zhuǎn)化為光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)弱與激酶活性呈正相關(guān).但是此方法也有不足之處：化合物有可能是抑制了熒光素酶的活性而使信號(hào)降低，這就很容易在篩選中造成假陽(yáng)性.Z′－LYTE法也是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可檢測(cè)絲氨酸／蘇氨酸、酪氨酸激酶的活性.當(dāng)激酶反應(yīng)發(fā)生時(shí)，標(biāo)記了熒光共振基團(tuán)的部分底物被磷酸化，而未被磷酸化的底物則被位點(diǎn)特異性的蛋白酶識(shí)別并且剪切，這種剪切破壞了熒光供體和熒光受體之間的能量轉(zhuǎn)移，使其顯示出較高的發(fā)射比（供體熒光基團(tuán)激發(fā)后供體發(fā)射和受體發(fā)射的比率），未被剪切的底物熒光供體和受體之間保持很低的發(fā)射比.發(fā)射比在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光下被檢測(cè)到，信號(hào)強(qiáng)弱與激酶活性呈反比.但其也有不足之處：在實(shí)驗(yàn)過程中需要設(shè)置0%和100%磷酸化率兩個(gè)內(nèi)參，并且線性范圍小，這些因素為高通量篩選的質(zhì)控帶來不便.同位素P32測(cè)活方法是最經(jīng)典的激酶測(cè)活方法，可以準(zhǔn)確地反映出底物磷酸化的程度，并帶來靈敏的信號(hào)窗口，但同位素很容易造成環(huán)境污染等一系列問題，且成本較高，實(shí)驗(yàn)操作也不便利.較之各種測(cè)活方法，HTRF因其靈敏度高、液體均相、操作簡(jiǎn)單、成本較低、對(duì)環(huán)境危害小等特點(diǎn)，故被選用.

作為IRE1激酶抑制劑的篩選模型，選用的實(shí)驗(yàn)條件既要照顧實(shí)驗(yàn)成本，又要是測(cè)定值足夠大，并有較大的信號(hào)窗，并且需要保證藥物的作用處于可檢測(cè)的線性范圍之內(nèi).本研究基于HTRF建立的IRE1激酶抑制劑高通量篩選模型使用Biomek FX自動(dòng)化加樣系統(tǒng)以保證實(shí)驗(yàn)的均一性以及準(zhǔn)確性，在每塊用于篩選的實(shí)驗(yàn)板上均設(shè)立空白和對(duì)照，檢測(cè)每塊板上的Z′因子和CV值，測(cè)定結(jié)果可信度高.

星型孢菌素是廣譜的激酶抑制劑，據(jù)本模型測(cè)定該化合物對(duì)于IRE1激酶抑制作用的IC50為（13.83±3.9）nmol／L，與文獻(xiàn)報(bào)道的（13±8.4）nmol／L相近，證明本實(shí)驗(yàn)方法較為可信，適宜進(jìn)行高通量篩選.

IRE1激酶相關(guān)小分子調(diào)節(jié)劑的研究?jī)H有零星報(bào)道，在大規(guī)模的藥物篩選中未見到.隨著更高密度微孔板、自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)、洗板機(jī)的聯(lián)合使用，有望將本模型的篩選通量進(jìn)一步提高，以滿足當(dāng)前對(duì)化合物篩選的更高要求.

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