盤基網(wǎng)柄菌KAx－3中類免疫細(xì)胞的初步研究

梁靜靜， 田 莉， 李 麗， 侯連生

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

0 引 言

免疫系統(tǒng)是所有生物必須具備的防御機(jī)構(gòu)，最初演化生成的單細(xì)胞原生動(dòng)物就有吞噬、銷毀和排斥異物的功能。這表明在生物多樣化之前，古老細(xì)胞在形成覓食機(jī)理的同時(shí)也具備了初步的防御功能.動(dòng)植物具備自身免疫相關(guān)的信號(hào)系統(tǒng)途徑，來(lái)抵抗細(xì)菌病原體等外界環(huán)境的威脅.動(dòng)物主要通過(guò)Toll－like感受器（TLRs），植物主要通過(guò)抗性R蛋白表現(xiàn)防御反應(yīng)［1，2］.無(wú)論是TLRs還是R蛋白都是通過(guò)富含亮氨酸的重復(fù)（LRRs）這一特殊結(jié)構(gòu)域，連接在細(xì)菌的激發(fā)子上并通過(guò)接頭蛋白和效應(yīng)蛋白（例如包含TIR域）發(fā)送信號(hào)，引起相關(guān)基因的表達(dá)，開啟并調(diào)節(jié)特殊的防御系統(tǒng)［3］.

盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）生活在土壤中并以細(xì)菌為食，因此它必須防御環(huán)境中的毒素和病原體.該菌株在多細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中也會(huì)受到環(huán)境的威脅.已報(bào)道盤基網(wǎng)柄菌從細(xì)胞聚集階段到子實(shí)體形成前，會(huì)形成一種具有半透過(guò)性的鞘與外界隔離，子實(shí)體階段又通過(guò)形成孢子來(lái)抵抗環(huán)境的威脅［4］.免疫是在吞噬作用的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的［5］，盤基網(wǎng)柄菌中可能也存在類似于免疫的細(xì)胞.子實(shí)體形成前，蛞蝓樣多細(xì)胞體會(huì)遷移一段時(shí)間，在這段時(shí)間里蛞蝓體很有可能通過(guò)自身免疫來(lái)防御外界的毒素和細(xì)菌病原體的威脅.因此，為了驗(yàn)證盤基網(wǎng)柄菌中是否存在這種類似于免疫的細(xì)胞，本研究以Ethidium bromide（EB）作為毒物，來(lái)觀察盤基網(wǎng)柄菌對(duì)該毒物的反應(yīng).結(jié)果表明，盤基網(wǎng)柄菌中存在一種能吞噬EB的細(xì)胞，隨著蛞蝓體的不斷爬行，這類特殊的細(xì)胞最終能將毒物脫出體外，我們把這類具有免疫樣功能的特殊細(xì)胞稱之為類免疫細(xì)胞；并檢測(cè)其存在于盤基網(wǎng)柄菌的哪類細(xì)胞中及在總細(xì)胞中所占的比例.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

盤基網(wǎng)柄菌野生型細(xì)胞株KAx－3.由多倫多大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室Dr.Siu惠贈(zèng).

1.1.2 EB溶液、Hoechst33342（HO）和碘化丙啶（PI）的配制

1 mL的超純水中配制濃度為10 mg／mL的EB原液，再把原液稀釋500倍成使用液，使其終濃度為20μg／mL.Hoechst33342（HO）為活體熒光染料且具有毒性，若濃度選擇不恰當(dāng)則可能會(huì)引起細(xì)胞死亡或應(yīng)急反應(yīng)［6］.實(shí)驗(yàn)前，用超純水將HO配置成10 mg／mL的原液.經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)選擇，最終設(shè)置HO的工作液濃度為10μg／mL.熒光染料PI溶于PBS（pH 7.4），終濃度為10μg／mL.以上溶液均4℃避光保存.

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與發(fā)育

盤基網(wǎng)柄菌野生型細(xì)胞KAx－3培養(yǎng)于SM固體培養(yǎng)基上，用好氧性克雷伯氏細(xì)菌（Klebstella aerogenes）喂養(yǎng)［7］.收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，用預(yù)冷的PB緩沖液（pH6.4）漂洗3次，棄上清，最后將細(xì)胞團(tuán)懸浮在PDF緩沖液中，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106cells／mL.取500μL細(xì)胞懸浮液均勻地鋪在預(yù)涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，先將其置于濕盒中，再將濕盒整體置于22℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)育.

1.2.2 觀察類免疫細(xì)胞

分別收集發(fā)育至細(xì)胞丘和蛞蝓體階段的細(xì)胞，滴加濃度為20μg／mL的EB溶液，處理15 min，1 h，2 h后用熒光顯微鏡觀察多細(xì)胞體吞噬EB的情況.用濃度為20μg／mL EB和10μg／mL HO共同染色，共聚焦顯微鏡確定EB在類免疫細(xì)胞中的位置.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）測(cè)定類免疫細(xì)胞

根據(jù)Ratner等的方法［8］，用Percoll密度梯度分離技術(shù)獲得發(fā)育至蛞蝓體階段的前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞.在收集的前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞中，分別加入PBS，4℃下650 g離心10 min.加入10μg／mL PI染色45 min后，用PBS緩沖液，650 g離心3次，每次5 min.細(xì)胞濃度調(diào)至1×108cells／mL，送流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞丘時(shí)期

饑餓狀態(tài)下，KAx－3細(xì)胞聚集發(fā)育至細(xì)胞丘階段，用熒光染料EB作為毒物處理此階段的細(xì)胞.無(wú)論是處理15 min（見圖1－1）、1 h（見圖1－2），甚至是處理2 h（見圖1－3），均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中有吞噬EB后而顯出的特別明亮的熒光點(diǎn)，僅能觀察到整個(gè)細(xì)胞丘在加入EB后顯現(xiàn)的暗紅色輪廓，并無(wú)吞噬EB的細(xì)胞.這表明盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育至細(xì)胞丘階段并不存在類免疫細(xì)胞.那么這一階段該生物體有何種保護(hù)機(jī)制？目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究.

圖1 EB處理細(xì)胞丘階段的細(xì)胞Fig.1 The cells during the mound stage were exposed to EB

2.2 蛞蝓體階段

以EB作為毒物，處理蛞蝓體階段的細(xì)胞.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，EB處理僅15 min后，發(fā)現(xiàn)EB被一類細(xì)胞吞噬，這類特殊的細(xì)胞在蛞蝓體內(nèi)有的作為細(xì)胞群出現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量較少，約是5到10個(gè)細(xì)胞聚成一團(tuán)，形成不變的細(xì)胞群（見圖2－1），有的則呈現(xiàn)為單獨(dú)的幾個(gè)細(xì)胞（見圖2－2）.此時(shí)，這些細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞主要附在蛞蝓體鞘的內(nèi)表面.EB處理1 h以后，可見到明顯的強(qiáng)熒光反應(yīng).隨著蛞蝓體的遷移，這些強(qiáng)熒光反應(yīng)的細(xì)胞團(tuán)也不斷向后移動(dòng)（見圖2－3）.處理2 h后，發(fā)現(xiàn)在蛞蝓體遺棄的粘液鞘的后端有強(qiáng)熒光反應(yīng)，表明EB已經(jīng)被丟棄在多細(xì)胞體外（見圖2－4）.由于這些特殊細(xì)胞不斷的被丟棄，推測(cè)可能有新的這類細(xì)胞在蛞蝓體內(nèi)產(chǎn)生.這類特殊細(xì)胞具備隔絕EB的能力，EB也隨著蛞蝓體的不斷爬行而排出.在蛞蝓體中，這類細(xì)胞吞噬毒物后將其運(yùn)送到有機(jī)體外面，因此，認(rèn)為這是一種具有免疫樣功能的類免疫細(xì)胞.同時(shí)還觀察到，類免疫細(xì)胞的細(xì)胞群不會(huì)隨毒物處理時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生大小改變.

2.3 EB在細(xì)胞內(nèi)的定位

以HO定位細(xì)胞核作為參照，觀察EB在細(xì)胞中存在的位置.經(jīng)過(guò)雙重染色，觀察到EB的定位并不在細(xì)胞核上（見圖3－1，3－2），排除EB染凋亡細(xì)胞核的可能，從而確定EB是作為毒物被吞入細(xì)胞內(nèi)的.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，幾乎整個(gè)細(xì)胞都能觀察到EB的熒光反應(yīng)，在細(xì)胞核的所處的位置，熒光反應(yīng)特別強(qiáng)烈（見圖3－3，3－4）.

圖2 EB處理蛞蝓體階段的細(xì)胞Fig.2 The cells were exposed to EB in the slug stage

圖3 EB在細(xì)胞中的定位Fig.3 EB was orientated in the disaggregated slug body

2.4 類免疫細(xì)胞的分布

為進(jìn)一步確定類免疫細(xì)胞是來(lái)自于前柄細(xì)胞還是前孢子細(xì)胞，以及該類細(xì)胞在蛞蝓體中的含量，以PI作為毒物，并用流式細(xì)胞儀（FACS）上機(jī)檢測(cè).收集發(fā)育至蛞蝓體的細(xì)胞，送樣檢測(cè)前，采用震蕩的方法將聚集的細(xì)胞打散，使之成為單個(gè)細(xì)胞.圖4－2為PI處理后FACS檢測(cè)結(jié)果，圖4－1為對(duì)照組（未用PI處理）檢測(cè)結(jié)果.數(shù)據(jù)表明，PI處理后有少部分細(xì)胞的吸光度增強(qiáng)，大約是原來(lái)的10倍.

Percoll密度梯度分離技術(shù)分離得到前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞.PI處理收集的前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞，未經(jīng)PI處理的前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞作為對(duì)照.FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（見圖4－3），前柄細(xì)胞經(jīng)PI處理后吸光度增大（見圖4－4）.但經(jīng)PI處理后的前孢子細(xì)胞（見圖4－6）與對(duì)照組（見圖4－5）相比，吸光度沒有變化.因此推斷類免疫細(xì)胞主要來(lái)源于前柄細(xì)胞，前孢子細(xì)胞中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)類免疫細(xì)胞.從結(jié)果也可以看出，類免疫細(xì)胞的含量較少，約占整個(gè)蛞蝓體細(xì)胞的10%.

圖4 FACS測(cè)定類免疫細(xì)胞的分布Fig.4 The distribution of immune－like cells by FACS

3 討 論

盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育的最終結(jié)果是形成由柄細(xì)胞和孢子細(xì)胞組成的子實(shí)體，整個(gè)發(fā)育過(guò)程歷經(jīng)4個(gè)階段：細(xì)胞聚集階段（aggregation），細(xì)胞丘（mound），蛞蝓體（slug）和子實(shí)體（fruiting body）［9］.孢子細(xì)胞在合適條件下萌發(fā)開始新的生命周期，而柄細(xì)胞是死亡細(xì)胞.所以盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育與高等生物發(fā)育相似，存在細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.一般認(rèn)為該菌株細(xì)胞丘時(shí)期的細(xì)胞大都是沒有分化的，至多處于初步分化階段［10］.通過(guò)比較用EB處理的細(xì)胞丘和蛞蝓體階段的細(xì)胞，可以看到兩者存在明顯區(qū)別：細(xì)胞丘內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞都成暗紅色狀態(tài)；而蛞蝓體內(nèi)僅少數(shù)細(xì)胞有明顯的強(qiáng)熒光反應(yīng)，這些細(xì)胞聚集成團(tuán)，起到了隔絕毒物的作用，即蛞蝓體內(nèi)吞噬毒物的細(xì)胞有明顯的聚毒物效應(yīng).這說(shuō)明只有已分化的細(xì)胞才能進(jìn)一步細(xì)分成各類細(xì)胞，另一方面也反證了細(xì)胞丘時(shí)期的細(xì)胞幾乎沒有分化.

為使種群能夠延續(xù)下去，換一句話是為使種群內(nèi)大部分細(xì)胞能生存下去，就必需犧牲一小部分細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱之為利他（altruistic）行為［11］.當(dāng)整個(gè)蛞蝓體遭受到外界毒物侵襲，有生存危險(xiǎn)時(shí)，只能犧牲一部分細(xì)胞來(lái)保存大部分細(xì)胞的生存.從數(shù)據(jù)來(lái)看，蛞蝓體內(nèi)類免疫細(xì)胞將外界毒物包裹在細(xì)胞的一定范圍中，并局限在蛞蝓體的表面部位，最終把毒物排出體外.而且最多犧牲10%細(xì)胞，從而使90%的細(xì)胞生存下來(lái)了.因此從某種意義上來(lái)說(shuō)，免疫系統(tǒng)的進(jìn)化除了有效抵御外界有害物質(zhì)的侵襲外，另一方面就是使整個(gè)種群能順利延續(xù)下去.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，類免疫細(xì)胞存在于前柄細(xì)胞中.這可能與前柄細(xì)胞參與自噬和蛋白的分解代謝有關(guān)［12］，也與多數(shù)基因在前柄細(xì)胞中表達(dá)，前柄細(xì)胞具備多種分化能力而前孢子細(xì)胞分化相對(duì)單一的現(xiàn)象相一致.

在盤基網(wǎng)柄菌的其他種類中，例D.dimigraformum，D.pupureum，D.citrinum和D.intermedium都發(fā)現(xiàn)具有解毒和免疫樣功能的細(xì)胞［13］.因此，推測(cè)低等的原生動(dòng)物盤基網(wǎng)柄菌中具備了簡(jiǎn)單的內(nèi)在的免疫細(xì)胞，能夠防御外界環(huán)境對(duì)其產(chǎn)生的威脅.通過(guò)生物信息學(xué)手段分析盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的基因組［14］，能夠鑒別出盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞內(nèi)存在動(dòng)植物中內(nèi)在的免疫信號(hào)蛋白的同源物，其中包括兩個(gè)含有TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白，它們類似于擬南芥的RPP5蛋白［15］；WRKY轉(zhuǎn)錄因子［16］，16個(gè)潛在的LRR結(jié)構(gòu)域受體，其中一些蛋白非常類似于水稻的Xa2l［17］。同時(shí)肺炎軍團(tuán)菌在盤基網(wǎng)柄菌中的復(fù)制方式與在巨噬細(xì)胞中相同，細(xì)菌生長(zhǎng)在與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連的囊泡中［18］。根據(jù)上述分析，推測(cè)盤基網(wǎng)柄菌內(nèi)存在免疫相關(guān)蛋白.但是這種類免疫細(xì)胞是像動(dòng)植物那樣在毒物誘導(dǎo)后通過(guò)特殊蛋白，啟動(dòng)免疫機(jī)制［16］還是在毒物誘導(dǎo)前，機(jī)體內(nèi)本身就存在；在毒物被排出蛞蝓體后，類免疫細(xì)胞是否仍然存在，有待于從分子水平上進(jìn)一步深入研究.

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