不同潮水量下普洱茶渥堆過程中微生物及酶活變化研究

胡 捷，劉通訊

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

不同潮水量下普洱茶渥堆過程中微生物及酶活變化研究

胡 捷，劉通訊*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模模擬渥堆，研究不同潮水量(30%、35%、40%、45%)下普洱茶渥堆過程中微生物及酶活的變化。結(jié)果表明:渥堆過程中，初期霉菌大量生長(zhǎng)，呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌種，后期堆溫下降，酵母、細(xì)菌開始大量生長(zhǎng)。35%潮水量下多酚氧化酶活性顯著高于其它組，且堆溫對(duì)多酚氧化酶活性影響不大，渥堆過程中微生物不分泌過氧化物酶。45%潮水量下蛋白酶活后期低于原料樣，相比其他組顯著偏低，說明潮水量過高、堆溫降低會(huì)在一定程度上抑制蛋白酶酶活。淀粉酶酶活隨潮水量增加顯著增強(qiáng)，但潮水量40%與45%差異不明顯。40%、45%潮水組茶胚果膠酶、纖維素酶酶活高于30%、35%。因此，選擇合適的潮水量有利于普洱茶品質(zhì)與功能的提高。

普洱茶，渥堆，潮水量，微生物，酶活

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料，在特定的環(huán)境條件下，經(jīng)微生物、酶和濕熱等綜合氧化作用，其內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化，從而形成獨(dú)特品質(zhì)特征［1］。渥堆發(fā)酵是形成普洱茶品質(zhì)的關(guān)鍵工序，而普洱茶渥堆前的茶胚潮水增濕是渥堆前的關(guān)鍵技術(shù)［2］。在渥堆過程中，霉菌能充分利用渥堆茶中的各種多糖為碳源，進(jìn)行糖代謝，產(chǎn)生單糖和雙糖，從而促進(jìn)了酵母菌和霉菌大量繁衍，抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，渥堆過程的濕熱作用又為微生物的活動(dòng)和代謝創(chuàng)造了良好的環(huán)境條件，亦給茶葉內(nèi)含物化學(xué)成份的變化提供了熱源，從而加強(qiáng)了酶系的活動(dòng)。微生物所分泌的酶對(duì)普洱茶內(nèi)含物成份中的各類物質(zhì)發(fā)生的物理化學(xué)變化產(chǎn)生極大的作用，使普洱茶香氣由純正的清香轉(zhuǎn)變?yōu)闈夂翊枷愫酮?dú)特的陳香，滋味由苦澀轉(zhuǎn)變?yōu)榇己突馗?，湯色由黃綠轉(zhuǎn)變?yōu)辄S紅明亮，葉底由青綠轉(zhuǎn)變?yōu)樽睾?，從而形成了普洱茶醇厚、甘滑、活順、陳香的品質(zhì)特點(diǎn)［3－5］。本研究以云南大葉種曬青毛茶為原料，通過不同潮水處理進(jìn)行渥堆，研究不同渥堆程度普洱茶中微生物(霉菌、酵母和細(xì)菌)、水解酶類(蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和淀粉酶)和氧化酶類(多酚氧化酶和過氧化物酶)活性的變化規(guī)律，有利于進(jìn)一步了解酶促氧化的作用機(jī)理，以期為微生物菌種、外源酶制劑的應(yīng)用和普洱熟茶生產(chǎn)工藝技術(shù)提升提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曬青毛茶 云南騰沖，2011年。

ESJ200－4電子分析天平 上海精科電子有限公司;SpectrumLab22PC型分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;富華420型三用水箱 金壇市富華儀器有限公司;LRH－250－S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠;YX－280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;GL－21M高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DHG90A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海索普儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

曬青毛茶，分別加水增濕至茶堆含水量30%、35%、40%、45%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室模擬渥堆，重復(fù)三次，每堆用量4kg。35%與45%潮水發(fā)酵時(shí)間在2011年11月～2011年12月，30%與40%發(fā)酵時(shí)間為2011年12月～2012年1月。

取樣:渥堆過程中，每6d進(jìn)行翻堆，共翻堆四次，并在翻堆前取樣。每次翻堆時(shí)分別在堆表、堆芯處采取五點(diǎn)取樣法，取樣50g，混合均勻后，即為堆表樣和堆芯樣。采樣后立即進(jìn)行水分含量測(cè)定，微生物測(cè)定和酶液制備(時(shí)間間隔不超過2h)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 茶胚含水率和堆溫的測(cè)定 茶胚含水率測(cè)定采用GB/T8304－2002，120℃烘干法。堆溫:每天用水銀溫度計(jì)分別于8:00、14:00和22:00時(shí)測(cè)定茶胚堆芯溫度，算出平均值。

1.3.2 微生物計(jì)數(shù) 霉菌、酵母總數(shù)測(cè)定:參照GB4789.15－2010，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

細(xì)菌總數(shù)測(cè)定［6］:采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。微生物計(jì)數(shù)單位為cfu/g(以干重計(jì))。

1.3.3 酶活測(cè)定 多酚氧化酶酶活測(cè)定采用鄰苯二酚比色法［7］。過氧化物酶酶活測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法［8］。蛋白酶酶活測(cè)定參考 SB/T10317－1999和文獻(xiàn)［9］的方法。果膠酶、纖維素酶和淀粉酶酶活測(cè)定采用 3，5－二硝基水楊酸(DNS)比色法［10－13］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及做圖采用Microsoft excel 2010進(jìn)行，用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同潮水量下普洱茶渥堆過程中堆溫變化

堆溫是普洱茶發(fā)酵過程中主要的控制因子。通過翻堆一方面調(diào)節(jié)了渥堆茶葉的溫度，同時(shí)也使堆內(nèi)和堆表茶葉都能受到濕熱和微生物作用。如此反復(fù)，形成了普洱茶特有的品質(zhì)。從圖1可知，曬青毛茶加水增濕后，堆溫迅速升高，在一翻至三翻過程中，30%渥堆組因潮水量過低導(dǎo)致堆溫不足，其余組堆溫始終保持在30～40℃之間，有利于微生物生長(zhǎng)繁殖和酶促反應(yīng)。結(jié)合圖1、圖2可以看到，35%、45%渥堆組堆溫比30%、40%組高(35、45%實(shí)驗(yàn)組渥堆時(shí)環(huán)境溫度較30、40%組高)，說明外界環(huán)境會(huì)影響茶胚堆溫，進(jìn)而影響渥堆品質(zhì)。

2.2 不同潮水量下普洱茶渥堆過程中微生物變化

圖1 不同潮水量下普洱茶渥堆過程中堆溫的變化Fig.1 Time courses of temperature of pile of tea leaves during the fermentation process for Pu－erh tea wetted with various water contents

圖2 普洱茶渥堆過程中室內(nèi)溫度的變化Fig.2 Time courses of room temperature during the fermentation process for Pu－erh tea

原料曬青毛茶經(jīng)加水增濕后，微生物開始大量生長(zhǎng)。從表1可知，渥堆初期不同潮水量下茶胚中霉菌數(shù)量大量增長(zhǎng)，主要以黑曲霉為主，隨后數(shù)量趨于穩(wěn)定，變化不明顯，這與Abe［14］的結(jié)論一致。如表2所示，在茶胚渥堆期間，不同潮水量處理樣本間霉菌總數(shù)變化不顯著;茶胚堆表處霉菌受翻堆次數(shù)變化非常顯著，一翻、二翻時(shí)達(dá)到最大，隨后開始顯著減少，三翻到四翻時(shí)變化不明顯。而堆芯處霉菌受翻堆次數(shù)變化不明顯。

霉菌能利用各種多糖作為碳源代謝產(chǎn)生大量的雙糖和單糖，從而促進(jìn)酵母菌迅速繁殖，成為渥堆后期優(yōu)勢(shì)菌種。茶胚渥堆期間酵母總數(shù)受翻堆次數(shù)影響非常顯著，不同潮水量處理對(duì)茶胚堆表酵母總數(shù)達(dá)顯著差異水平，對(duì)堆芯處變化不明顯。40%潮水量下堆表處酵母相比其他組生長(zhǎng)旺盛;堆表處酵母在二翻到三翻時(shí)顯著增加，堆芯處三翻到四翻顯著增加。從表3可知，在外界溫度適宜的條件下，如35%、45%潮水組，酵母數(shù)量與堆溫呈顯著負(fù)相關(guān)，說明渥堆后期堆溫下降也是酵母開始大量生長(zhǎng)的原因之一。

細(xì)菌也是渥堆過程中重要的微生物類群之一，在渥堆中后期表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌。此結(jié)果與前人研究差異較大，周紅杰等人發(fā)現(xiàn)，渥堆過程中曲霉始終處于優(yōu)勢(shì)地位，酵母菌次之，細(xì)菌數(shù)目極少［15］。不同潮水量和不同翻堆次數(shù)處理下細(xì)菌總數(shù)達(dá)非常顯著差異水平。35%、40%潮水量下堆表處細(xì)菌總數(shù)變化無明顯差異，但相比30%、45%組生長(zhǎng)旺盛，40%潮水量下堆芯處細(xì)菌在渥堆后期相比其它組生長(zhǎng)旺盛;堆表處細(xì)菌二翻到三翻顯著增長(zhǎng)，堆芯處二翻后顯著增長(zhǎng)。一方面由于初期霉菌大量繁殖，一定程度上抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，另一方面由于茶多酚對(duì)細(xì)菌具有廣泛的抑制作用，并且茶多酚的抑菌能力與其濃度呈正效應(yīng)關(guān)系［16］。而曬青毛茶中茶多酚含量較高，且在整個(gè)發(fā)酵過程中，總體上呈下降趨勢(shì)，這也是發(fā)酵過程前期細(xì)菌數(shù)量較少，而后期有所增加的一個(gè)重要原因。

表1 不同潮水量下普洱茶在渥堆過程中微生物和酶活變化Table 1 Time courses of microbes and enzyme activities during pile－fermentation for Pu－erh tea wetted with various water contents

表2 潮水量和翻堆次數(shù)對(duì)各生化指標(biāo)變化的顯著性差異Table 2 Significant difference of water content and turning number on changes of biochemical characters

2.3 渥堆過程中氧化酶類活性變化規(guī)律

原料曬青毛茶的多酚氧化酶活性極低，僅(0.51±0.08)U/g(見表1)。潮水量對(duì)多酚氧化酶酶活的影響非常顯著，35%潮水量下酶活顯著高于其它組;翻堆次數(shù)對(duì)堆芯處酶活的影響非常顯著，對(duì)堆表影響不明顯。堆芯處酶活呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，三翻時(shí)達(dá)到最大。實(shí)驗(yàn)中用愈創(chuàng)木酚法沒能測(cè)出過氧化物酶酶活性，說明經(jīng)高溫殺青后的曬青毛茶原料沒有過氧化物酶，而且渥堆過程中微生物也不分泌過氧化物酶。

2.4 渥堆過程中水解酶類活性變化規(guī)律

毛茶中蛋白酶和淀粉酶酶活分別為酶活(320±31)μg/(g·min)和(916 ±20)μg/(g·min)，說明在產(chǎn)生微生物前，這兩種酶已經(jīng)作為內(nèi)源酶存在于茶葉中。潮水量和翻堆次數(shù)對(duì)蛋白酶及淀粉酶酶活的影響非常顯著。渥堆過程中蛋白酶酶活在一翻時(shí)達(dá)到最大，如35%潮水量堆芯處達(dá)(1049±70)μg/(g·min)。隨后開始顯著減少，后期增強(qiáng)，呈“雙峰”變化，說明渥堆期間茶胚微生物代謝種群可能發(fā)生變化;45%潮水量下蛋白酶活后期低于原料樣，相比其他組顯著偏低，說明潮水量過高會(huì)在一定程度上抑制酶活。茶胚淀粉酶酶活隨潮水量增加顯著增強(qiáng)，但潮水量40%與45%差異不明顯;堆表處淀粉酶酶活隨翻堆次數(shù)變化呈現(xiàn)先增大后減少的顯著趨勢(shì)，三翻時(shí)達(dá)到最大值，堆芯處隨翻堆次數(shù)變化顯著，后期變化不明顯。

表3 不同潮水量下茶胚堆溫與微生物菌群、酶活的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation between temperature and microbes and enzyme activities with various water contents

表4 不同潮水量下茶胚微生物和酶活性的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation between microbes and enzyme activities with various water contents

毛茶中果膠酶和纖維素酶酶活分別為(84±22)μg/(g·min)和(88 ±23)μg/(g·min)，經(jīng)加水增濕后酶活變化非常明顯。潮水量對(duì)堆芯果膠處酶活影響非常顯著，對(duì)堆表影響不明顯，其中潮水量40%堆芯處酶活相比35%顯著增強(qiáng)，而30%與35%、40%與45%分別差異不明顯;翻堆次數(shù)對(duì)果膠酶酶活影響非常顯著，渥堆時(shí)二翻到三翻酶活顯著增強(qiáng)，隨后變化不明顯，其中堆表處一翻到二翻差異不明顯，堆芯處一翻到二翻顯著減少。潮水量和翻堆次數(shù)對(duì)堆芯處纖維素酶酶活影響非常顯著，對(duì)堆表影響不明顯。堆芯處酶活在二翻到三翻時(shí)酶活顯著增強(qiáng);在潮水量40%、45%下酶活差異不明顯，但活性顯著高于30%、35%。

2.5 不同潮水量下茶胚堆溫與微生物菌群、酶活的關(guān)系

普洱茶在渥堆過程中，由于微生物大量繁殖呼吸放熱，導(dǎo)致堆溫上升(圖1)。而堆溫上升又會(huì)進(jìn)一步影響茶胚微生物繁殖以及酶促反應(yīng)強(qiáng)度。但從表3中知，多酚氧化酶活性幾乎不受堆溫影響。在茶胚潮水量為45%時(shí)，堆溫與霉菌、蛋白酶呈顯著正相關(guān)，與酵母、細(xì)菌、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶呈顯著負(fù)相關(guān)。渥堆初期，堆溫上升，霉菌生長(zhǎng)，蛋白酶活性最強(qiáng)，到中后期堆溫下降，酵母、細(xì)菌大量生長(zhǎng)，淀粉酶、纖維素酶和果膠酶活性開始增強(qiáng)，從而形成45%組獨(dú)特的普洱風(fēng)味。

2.6 不同潮水量下茶胚酶活性變化與微生物的關(guān)系

霉菌中黑曲霉、酵母菌以及細(xì)菌是分泌胞外酶極為豐富的菌種，它不僅可以分泌纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶和各種糖化酶等水解或裂解酶類，還可以釋放多酚氧化酶等氧化酶類。渥堆中微生物種群的更迭及數(shù)量的消長(zhǎng)，決定了整個(gè)體系中酶系的種類與活性水平。為了找出不同潮水量下每一種酶與微生物之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)渥堆過程中各種酶活性和微生物種群數(shù)量之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果如表3所示。

從表4可知，渥堆中微生物分泌胞外酶受初始潮水量和通氣效果影響。潮水量35%、40%下堆表處多酚氧化酶與酵母存在顯著相關(guān)，而堆芯處則與霉菌顯著相關(guān);潮水量30%則與之相反，潮水量45%下堆表處與細(xì)菌存在一定關(guān)聯(lián)，堆芯處與微生物消長(zhǎng)近乎無關(guān)聯(lián)。蛋白酶在45%潮水量下與霉菌顯著相關(guān)，在40%潮水量堆表、30%堆芯處下兩者也顯著相關(guān)，而在35%潮水量堆表處蛋白酶則與酵母顯著相關(guān)。潮水量40%、45%茶胚果膠酶、纖維素酶、淀粉酶與各類微生物均存在顯著相關(guān)，而在潮水量偏低時(shí)不明顯。與劉仲華結(jié)論基本一致，多酚氧化酶、纖維素酶和果膠酶活性與真菌類數(shù)量變化(主要是酵母菌和霉菌)存在顯著相關(guān);酸性蛋白酶僅與真菌類的黑曲霉有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度;而過氧化酶活性與細(xì)菌和真菌類微生物的消長(zhǎng)近乎無相關(guān)性［5］。

3 結(jié)論與討論

渥堆開始時(shí)茶胚潮水量的高低是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因子，在很大程度上決定了微生物繁殖速度及菌群分布，進(jìn)而影響到茶胚溫度和pH變化，決定了普洱茶渥堆的效果。

普洱茶渥堆過程中微生物變化是極其復(fù)雜的，有的微生物自始至終對(duì)普洱茶品質(zhì)形成發(fā)揮著積極的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一階段發(fā)揮著形成普洱茶獨(dú)特風(fēng)格的作用，有的微生物則不利于普洱茶品質(zhì)的形成。

普洱茶初制中，鮮葉經(jīng)高溫殺青后，固有的內(nèi)源酶系統(tǒng)活性已基本鈍化。然而在渥堆中微生物代謝所分泌的胞外酶形成新的酶系統(tǒng)，為茶葉中茶多酚的氧化、纖維素的分解、果膠質(zhì)的裂解、蛋白質(zhì)的降解提供了有效的生化動(dòng)力，這些酶使茶的內(nèi)含物發(fā)生了復(fù)雜的變化，影響普洱茶色、香、味品質(zhì)形成。潮水量45%的茶胚在渥堆初期，堆溫上升，霉菌大量生長(zhǎng)，蛋白酶活性增強(qiáng)，到中后期堆溫下降，酵母、細(xì)菌大量繁殖，淀粉酶、纖維素酶和果膠酶活性逐漸增強(qiáng)，從而形成45%組獨(dú)特的普洱風(fēng)味。

在普洱茶渥堆過程中，由于不同潮水量的茶坯堆溫、含水量的差異，導(dǎo)致所著生微生物以及所釋放胞外酶酶活強(qiáng)弱不一，進(jìn)而影響普洱茶品質(zhì)形成。因此，選擇合適的潮水量有利于普洱茶品質(zhì)與功能的提高。本實(shí)驗(yàn)通過小規(guī)模自然渥堆研究其微生物及酶活的變化，可以在此基礎(chǔ)上，通過選擇合適的微生物菌劑、外源酶制劑，進(jìn)一步探討對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響，為普洱茶發(fā)酵工藝的改進(jìn)提供一定的理論依據(jù)。

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Study on change of microbes and enzyme activities of Pu－erh tea during pile－fermentation process with various water contents

HU Jie，LIU Tong－xun*
(College of Light and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The change ofmicrobes and enzyme activities was investigated during differentstages of pile－fermentation process of Pu－erh tea with various water contents(30%，35%，40%，45%)in laboratory－scale.During pile－fermentation process，mould was dominant strain growth in large number at the beginning，then yeast and bacteria increased later while pile temperature went down.PPO of 35%group had significantly higher enzyme activity than others，and pile temperature had little effect on PPO.There was no POD secreted by microorganisms during pile－fermentation process.Protease of 45%group in later phase of fermentation had lower enzyme activity than raw material，and was significantly lower than other groups.It indicated that protease could be inhibited by high water content and low temperature.Amylase activity was significantly enhanced with water content increased，but there was no significant difference between 40%and 45%groups.Pectinase and cellulase of 40%，45%group had higher enzyme activity than 30%，35% group.Therefore，proper water content will be benefit to the improvement of quality and functions of Pu－erh tea.

Pu－erh tea;pile－fermentation;water content;microbe;enzyme activity

TS272.5

A

1002－0306(2012)17－0093－05

2012－02－27 *通訊聯(lián)系人

胡捷(1988－)，男，碩士研究生，研究方向:糧食油脂及植物蛋白工程。