恩諾沙星化學發(fā)光免疫分析試劑盒的研制

劉 鄧，丁 飛，侯瑞霞，徐振林，孫遠明，楊金易，*

(1.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642;2.國家肉制品質量監(jiān)督檢驗中心(漯河)，河南漯河 462000)

恩諾沙星化學發(fā)光免疫分析試劑盒的研制

劉 鄧1，丁 飛2，侯瑞霞1，徐振林1，孫遠明1，楊金易1，*

(1.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642;2.國家肉制品質量監(jiān)督檢驗中心(漯河)，河南漯河 462000)

主要研制一種基于魯米諾－辣根過氧化物酶體系的化學發(fā)光免疫分析試劑盒，用于檢測食品中的痕量恩諾沙星殘留。反應條件優(yōu)化結果為:最佳包被抗原濃度為0.5ng/mL，最佳抗體稀釋倍數為1∶2000，藥物稀釋液為0.01mol/L的PBST溶液，一抗反應時間為30min。研究結果顯示:本文研制的試劑盒的回歸曲線方程是y=－22842x+172936，檢測線性范圍是0.024～2.76ng/mL，IC50為0.106ng/mL，對蜂蜜、牛奶、魚肉和蝦肉樣本的添加回收率在96%～116%、90%～97%、92%～112%、86%～112%之間，批內和批間變異系數均小于15%，試劑盒在4℃下有效期為180d。

恩諾沙星，化學發(fā)光免疫分析，試劑盒

恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)屬于第三代氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，FQs)藥物中的一種，廣泛應用于動物和人類多種感染性疾病的治療［1］。但是，隨著恩諾沙星在養(yǎng)殖產業(yè)中的廣泛應用，其藥物殘留問題已引起廣泛的關注，恩諾沙星在動物源食品中的殘留可引起神經中毒、腎功能損傷、過敏反應等毒副作用，并且容易誘使人類致病菌產生耐藥性，導致體內環(huán)境中耐藥性菌株的增加，從而使該類藥物在人類疾病的治療中產生耐藥性［2－5］。食品中恩諾沙星殘留的檢測方法主要分為儀器檢測法和免疫分析法兩大類。儀器檢測法主要包括有高效液相色譜法、液相色譜－質譜聯用法等，這些方法對待測樣品前處理要求高，操作繁瑣，所需儀器昂貴，不適合大批量的篩選檢測和現場檢測［6－7］。免疫分析法則包括酶聯免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學發(fā)光免疫分析等多種方法。該類方法具有靈敏度高，特異性強，能適應大量樣品的快速檢測等特點。根據報道，陳雪嵐等［8］研制的恩諾沙星酶聯免疫分析試劑盒的IC50是10ng/mL，趙莉莉等［9］建立的恩諾沙星時間分辨分析方法的IC50是3.4ng/mL。近年來，隨著人們食品安全意識的逐漸增強，人們對有害物質殘留的檢測要求也越來越高，因此建立靈敏度更高的檢測方法成為研究熱點之一?；瘜W發(fā)光酶聯免疫分析法是一種新型的免疫分析方法之一，該方法進行檢測時不需要外界光源，減少了背景干擾，可以進一步提高恩諾沙星殘留檢測的靈敏度，主要用于有害物的痕量和超痕量的檢測［10－13］。本文在合成人工抗原及制備多克隆抗體的研究基礎上，基于魯米根過氧化物酶體系(HRP－Luminol－H2O2system)，研制恩諾沙星化學發(fā)光免疫分析試劑盒，為恩諾沙星殘留檢測提供一種新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

99.5%恩諾沙星 浙江國邦藥業(yè)有限公司;HRP標記羊抗兔IgG 武漢博士德生物工程有限公司;恩諾沙星－卵清白蛋白偶聯物(ENR－OVA)、恩諾沙星多克隆抗體 本實驗室提供;恩諾沙星ELISA試劑盒 廣州萬聯生物科技有限公司;乙腈 色譜純，其他試劑均為國產分析純。包被緩沖溶液:1.69g Na2CO3，2.95g NaHCO3加去離子水定容至 1000mL;洗滌緩沖液:3.0g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.6mL Tween－20加蒸餾水定容至1000mL;封閉液:5g脫脂奶粉加去離子水定容至100mL;0.01mol/L PBST溶液:8.5g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.9g KH2PO4，0.9g KCl，0.6mL Tween－20，去離子水定容至 1000mL;0.01mol/L的T液:取0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)與0.2mol/L的 HCl溶液混合，再加入0.1%BSA和0.04%NaN3;CLEIA底物液 A:Luminol－Na 4mg溶于20mL 0.1mol/L的T液中;CLEIA底物液B:2mg對碘酚溶于100μL二甲基亞砜(DMSO)，加入4μL 3%的雙氧水(H202);1mg/mL恩諾沙星標準品工作液:稱取50mg恩諾沙星標準品，溶于50mL的無水甲醇中。

Wellwash MK2洗板機 美國 Thermo公司;6K－15高速冷凍離心機 德國Sartorius公司;Wallac VITOR31420多標記分析儀 美國PE公司;微量移液器 美國Eppendorf公司;高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 恩諾沙星icCLEIA檢測方法的建立

1.2.1.1 恩諾沙星icCLEIA檢測基本步驟 將包被原用包被緩沖液稀釋成合適的濃度，100μL/孔加入化學發(fā)光板孔中，置于37℃孵育箱中孵育12h，取出化學發(fā)光板，用洗板機洗2次，拍干，每孔加入120μL封閉液，置于37℃孵育箱中封閉3h，甩干孔中液體，放置在37℃烘箱中烘1h，備用。

將恩諾沙星標準品工作液稀釋為0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29ng/mL 8 個梯度，取50μL 各梯度標準品到包被好的板條中，加入50μL稀釋好的抗體，在25℃條件下反應一段時間，用洗板機洗6次。

每孔加入100μL用T液稀釋10000倍的酶標二抗，在25℃條件下反應20min，用洗板機洗6次。

然后取等量的化學發(fā)光液A與B混合均勻后，將一定量的化學發(fā)光液加入到洗好的板條中，反應一定的時間，讀數。

1.2.1.2 icCLEIA反應條件的優(yōu)化 根據以上檢測步驟優(yōu)化icCLEIA免疫反應體系中的包被原濃度、一抗稀釋倍數、藥物稀釋液、免疫反應時間確定免疫反應工作條件;優(yōu)化發(fā)光反應中發(fā)光液添加量、發(fā)光反應時間確定發(fā)光反應工作條件。

1.2.1.3 icCLEIA標準曲線的繪制 以恩諾沙星濃度的對數值lgC為橫坐標，各稀釋度發(fā)光計數RLU為縱坐標，按照RLU－lgC四參數對數擬合繪制恩諾沙星icCLEIA方法的標準曲線。根據標準曲線計算出該方法的半抑制濃度(IC50)和線性范圍(IC20～IC80)。

1.2.2 試劑盒組建 根據以上優(yōu)化條件組建試劑盒，確定試劑盒的組成和檢測步驟。

1.2.3 添加回收實驗 選取蜂蜜，液態(tài)牛奶，魚肉，蝦肉作為添加回收實驗樣本。其前處理方法如下:

蜂蜜:稱取3份樣品每份1g置于3個15mL離心管中，分別添加1、5、10ng標準品于樣品中，放置10min后分別加入4mL蒸餾水，充分振蕩均勻，再加入4mL乙酸乙酯，振蕩20min，用離心機以10000r/min的轉速離心10min，吸取上層乙酸乙酯層2mL置于雞心瓶中用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去離子水復溶，去除上層正己烷層，取下層清液50μL待測。

肌肉組織:稱取均質后肌肉組織3份，每份各1g置于3個15mL離心管中，分別添加1、5、10ng標準品，靜置10min后分別加入4mL去離子水，充分振蕩均勻，然后用離心機以10000r/min的轉速離心10min，分別吸取上層清液2mL于3個10mL離心管中，加入2mL正己烷，振蕩10min，以10000r/min的轉速離心10min，除去上層正己烷層，取下層清液50μL待測。

牛奶:吸取牛奶樣品3份，每份1g置于3個15mL離心管中，每管牛奶樣品分別添加1、5和10ng的恩諾沙星標準品，充分振蕩均勻，靜置10min。加入6mL乙腈，用去離子水定量到10mL。振蕩20min，用離心機以10000r/min的轉速離心10min，分別各取上層清液5mL于雞心瓶中用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至干，加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去離子水復溶，除去上層正己烷，取下層清液50μL待測。

樣本經前處理后，用研制的試劑盒進行測定，根據標準曲線計算出添加的恩諾沙星濃度、添加回收率與變異系數。

1.2.4 試劑盒性能評價

1.2.4.1 精密性實驗 以批內變異和批間變異衡量試劑盒的精密度。在添加回收實驗中，取同一批次包被板，對同批樣品同種樣品進行檢測，計算批內變異，得到同批樣品中同種樣品的精密度。對不同批樣品中同種樣品進行檢測，計算批間變異，得到不同批次樣品中同種樣品的精密度。計算公式為:

1.2.4.2 特異性實驗 將恩諾沙星與環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺等類似物按相同倍比稀釋，按照恩諾沙星icCLEIA檢測步驟，在相同條件下分別作分析物及其類似物的競爭抑制曲線，計算其類似物對恩諾沙星多克隆抗體的交叉反應率和IC50。

1.2.4.3 保存期實驗 將試劑盒置于4℃環(huán)境中，保存6個月，每個月測定一次，置于37℃環(huán)境中，保存5d，每天測定一次。分別測定零標準品的發(fā)光值B0和50%藥物抑制濃度對應的化學發(fā)光值B，計算二者的比值B/B0。當B/B0＞0.7時，即可判定試劑盒已失效［14］。在37℃放置1d相當于在4℃放置45d，經過換算可確定CLEIA試劑盒的保存期。

采用Waters高效液相色譜儀，檢測條件是:檢測器采用紫外檢測器，檢測波長為280nm，流動相流速為1.0mL/min，進樣量設為20μL，柱溫為25℃。色譜柱采用Atlantis C18色譜柱(長度160mm×4.6mm，粒徑5.0μm)。流動相為:磷酸溶液/三乙胺(0.05mol/L，pH2.4)+乙腈=82+18。

1.2.4.5 HPLC，ELISA，CLEIA三種方法性能對比采用商品化恩諾沙星ELISA試劑盒，參考試劑盒說明書，繪制出恩諾沙星ELISA標準曲線并求出其IC50，比較三種方法的靈敏性。

2 結果與分析

2.1 icCLEIA反應條件的優(yōu)化

對包被原濃度、一抗稀釋倍數、標準品稀釋液、一抗反應時間等免疫反應工作條件進行優(yōu)化(圖1a～圖1d)，通過比較RLUmax/IC50的值大小(值越大方法的檢測效果越好)，確定了icCLEIA最佳免疫反應條件［16］:即包被濃度5ng/mL，抗體稀釋倍數為1∶2000，抗體反應時間 30min，標準品稀釋液為0.01mol/L PBST溶液;對發(fā)光液添加量、添加發(fā)光液后到放入發(fā)光儀讀數之間間隔的時間等發(fā)光反應工作條件進行優(yōu)化(圖1e～圖1f)，確定發(fā)光反應最佳工作條件:發(fā)光液添加量為100μL，添加后3～5min之內讀數。

2.2 icCLEIA標準曲線的繪制

根據優(yōu)化的條件按照檢測步驟進行檢測，每個梯度做5個平行。根據所得的數據，以恩諾沙星濃度的對數值lgC為橫坐標，各稀釋度發(fā)光計數RLU為縱坐標，繪制標準曲線。所得曲線如圖2所示。其回歸曲線方程為 y=－22842x+172936，R2=0.9912。經計算得該方法檢測的線性范圍是0.024～2.76ng/mL，IC50是 0.106ng/mL。

2.3 試劑盒的組建

2.3.1 試劑盒組成 試劑盒的組成如表1所示。

[43]Joshua R. Loftus, et al., “Causal Reasoning for Algorithmic Fairness”, May. 15, 2018, https://arxiv.org/abs/1805.05859.

表1 試劑盒的組成Table 1 The composition of the CLEIA kit

2.3.2 檢測方法 取出試劑盒，于室溫(25℃左右)平衡20min。取出化學發(fā)光板，將標準品和樣品按每孔50μL依次加入到空白微孔中，做兩個平行。在以上各孔中每孔加入50μL的恩諾沙星抗體，放入孵育箱中于37℃下孵育30min。將濃縮洗液稀釋100倍，每孔加入220μL，充分洗滌5次，然后用吸水紙拍干。每孔加入100μL的酶標記物，放入孵育箱中于37℃下孵育15min，用洗液洗滌5次，用吸水紙拍干。將化學發(fā)光A液和B液等量混勻，每孔加入100μL，加入后3～5min內在化學反光儀上讀出各孔的化學發(fā)光值。根據標準品各孔的讀數繪制標準曲線，根據樣品各孔的讀數確定恩諾沙星的含量。

圖1 不同工作條件對icCLEIA靈敏度的影響Fig.1 Influence of different conditions on sensitivity of icCLEIA

表3 恩諾沙星類似物的交叉反應實驗Table 3 Cross－reactivity test of NER analogues

表4 保存期實驗Table 4 Storage period of the experiment

圖2 ENR的icCLEIA標準曲線(n=5)Fig.2 Standard curve of icCLEIA for ENR(n=5)

2.4 添加回收實驗結果

采用上述化學發(fā)光方法，對蜂蜜、牛奶、蝦肉、魚肉進行檢測，每個添加濃度水平做5個平行，結果顯示(見表2):蜂蜜樣品的平均回收率為96%～116%，牛奶樣品的回收率為90%～97%，蝦肉樣品的平均回收率為92%～112%，魚肉樣品的回收率為86%～112%。

表2 蜂蜜、牛奶、蝦肉、魚肉樣品添加回收實驗(n=5)Table 2 Recovery test results with honey，milk，shrimp and fish as samples(n=5)

2.5 精密性實驗結果

方法對批內變異和批間變異見表2。由結果得出，批內和批間變異系數均小于15%，對實際樣品檢測的精密度符合要求。

2.6 特異性實驗結果

恩諾沙星結構類似物的交叉反應實驗結果如表3所示，由實驗結果看出，所用的恩諾沙星抗體特異性好，與環(huán)丙沙星和氧氟沙星的交叉反應率分別為1.43%和1.08%，與其他結構類似物和功能類似物的交叉反應率均小于0.1%。

2.7 保存期實驗結果

結果如表4所示，在4℃環(huán)境中，保存6個月以內，B/B0值均小于0.7，說明試劑保存狀態(tài)良好。由4℃和37℃實驗得出，恩諾沙星試劑盒在4℃狀態(tài)下至少能保存6個月。

2.8 相關性實驗結果

采用HPLC方法，所得的結果為:目標峰形如圖3所示，得到恩諾沙星保留時間為13.70min;繪制恩諾沙星標準曲線如圖4所示，標準曲線在10～1000ng/mL范圍內保持線性關系，回歸曲線為y=158000x－216，R2=0.999530。

圖3 恩諾沙星標準溶液(500ng/mL)HPLC圖Fig.3 The HPLC fig of enrofloxacin standard solution(500ng/mL)

采用HPLC方法，對蜂蜜、牛奶、魚肉、蝦肉進行檢測，分別于50、100、250ng/g三個濃度水平做添加回收實驗，得出HPLC法添加回收數據。將經過前處理后此三個濃度水平的樣品用0.01mol/L的PBST溶液稀釋50倍，再用研制的CLEIA試劑盒進行檢測，每個濃度做5個平行，得到CLEIA法添加回收實驗數據，將實驗數據乘以50后與HPLC法實驗結果做比較，得出的HPLC和CLEIA相關性如圖5所示，由相關性分析得到擬合直線的相關系數R2=0.9961，斜率約為1，說明HPLC與CLIEA檢測結果相關性符合要求。

2.9 HPLC，ELISA，CLEIA 性能對比

三種恩諾沙星殘留檢測方式的性能比較見表7:本文研制的CLEIA試劑盒的IC50最低，靈敏度最好。根據新聞報道，日本在2009年將動物類食品恩諾殘留限量標準調整至10ppb，由于一些動物組織如肝臟、貝類等經過前處理后會存在嚴重的基質效應，要再經過稀釋10～20倍進行檢測。而經過稀釋后樣本中恩諾沙星的濃度如果偏離恩諾沙星ELISA試劑盒的檢測范圍，就會影響恩諾沙星ELISA試劑盒檢測的準確度［11］。而本文研制的恩諾沙星CLEIA試劑盒其檢測線性范圍在0.024～2.76ng/mL之間，可以彌補恩諾沙星ELISA試劑盒的不足，并豐富恩諾沙星殘留檢測的產品線［8］。

表7 HPLC、ELISA和CLEIA靈敏度對比表Table 7 The sensitivity comparison table between HPLC，ELISA and CLEIA

圖4 ENR的HPLC標準曲線Fig.4 Standard curve of HPLC for ENR

圖5 HPLC和CLEIA相關性曲線圖(n=5)Fig.5 Correlation between HPLC and CLEIA(n=5)

3 結論

本文研制了恩諾沙星的化學發(fā)光免疫分析試劑盒，該試劑盒的IC50為0.106ng/mL，線性范圍在0.024～2.76ng/mL之間;應用于各樣品的添加回收率均落在80%～120%之間，批內變異和批間變異均小于15%;與結構類似物和功能類似物的交叉反應率都小于1.43%;在4℃環(huán)境中，能保存180d以上;與HPLC方法進行對比，其線性相關系數R2=0.9961。目前關于恩諾沙星的化學發(fā)光免疫分析試劑盒的研制在國內報道很少，本文研制的試劑盒的靈敏度和特異性不僅能夠滿足目前檢測的需求，同時能夠滿足趨于嚴格的檢測標準，為恩諾沙星殘留限量新標準制定提供參考［19－20］。

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Development of an indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay kit for detecting of enrofloxacin residue

LIU Deng1，DING Fei2，HOU Rui－xia1，XU Zhen－lin1，SUN Yuan－ming1，YANG Jin－yi1，*
(1.Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Provence，Collage of Food Science，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;2.National Meat Products Quality Supervision and Inspection Center(Luohe)，Luohe 462000，China))

A HRP－Luminol－H2O2system based indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay(CLEIA)kit for determination of enrofloxacin(ENR)residues was developed.The CLEIA conditions were optimized.The optimal concentration of coating antigen was 0.5ng/mL and the antibody dilution was 1∶2000.Using PBST as assay buffer，the incubation time for the primary antibody was 30min.Under the optimal conditions，the standard curve was developed.The regression equation for ENR was y=－22842x+172936 with a linear detection ranging from 0.024 to 2.76ng/mL.The IC50was 0.106ng/mL.The averaged recoveries of ENR from spiked honey，milk，shrimp and fish samples were 96%～116%，90%～97%，92%～112%and 86%～112%，respectively.The coefficient of variation of intra－assay and inter－assay was less than 15%.The developed kit can be stored at 4℃ for 180 days.

enrofloxacin;chemiluminescence enzyme immunoassay;kit

TS207.5

A

1002－0306(2012)17－0325－05

2012－03－06 *通訊聯系人

劉鄧(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品質量與安全。

廣東省教育部產學研結合項目(2010A090200084，2011A090200029，2009B090300409)。