功能性短肽的分類及其酶解制備方法

李昊劍，楊良嶸，魏雪團，邢慧芳，劉會洲

(生化工程國家重點實驗室，綠色過程與工程院重點實驗室，中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190)

功能性短肽的分類及其酶解制備方法

李昊劍，楊良嶸*，魏雪團，邢慧芳，劉會洲

(生化工程國家重點實驗室，綠色過程與工程院重點實驗室，中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190)

近年來，蛋白質(zhì)中功能性短肽的營養(yǎng)、功能性、生理活性和其應(yīng)用價值越來越引起人們的關(guān)注。功能性短肽來源廣泛，通過合適的蛋白酶酶解得到的功能性短肽，具有諸如降血壓、提高免疫力、促進消化、抗氧化、神經(jīng)調(diào)節(jié)和抗菌等生物活性。本文綜述了功能性短肽的來源和分類，討論了植物蛋白源短肽和動物蛋白源短肽的特點，通過選擇蛋白酶和優(yōu)化酶解條件分析了酶解制備短肽的方法，為開發(fā)和深入研究功能性短肽產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

功能性短肽，分類，酶解，制備

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和生物科學(xué)的發(fā)展，各種新的功能性短肽不斷地被發(fā)現(xiàn)，其具有很高的開發(fā)價值，研究功能性短肽越來越受到人們的重視。肽是由2個及2個以上氨基酸分子通過肽鍵相互連接的線性聚合物。含2個、3個、4個氨基酸脫水縮合而成的肽分別稱之為二肽、三肽、四肽。一般說來，肽鏈上氨基酸殘基10個以下，特別是3～9個氨基酸聚合而成的肽稱短肽，也稱寡肽，含氨基酸10到50個的稱為多肽，50個以上的稱蛋白質(zhì)［1］。一般認為，功能肽性短肽是特定的蛋白質(zhì)片段，具有一定生理調(diào)節(jié)功能的肽類混合物。很多研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在人體內(nèi)更多是以短肽的形式進行吸收，在腸道中，蛋白質(zhì)通過消化酶酶解后，短肽以完整的形式被吸收而進入血液循環(huán)系統(tǒng)。這類特殊的蛋白質(zhì)片段對機體的功能及狀態(tài)具有積極作用，并最終可能促進機體健康［2］。功能性短肽具有多種功能性、高效、安全等優(yōu)勢，已越來越多的引起人們重視，其工業(yè)化生產(chǎn)也成為當(dāng)前多肽類藥物和功能性食品添加劑開發(fā)的趨勢［3］。本文概述功能性短肽的分類以及蛋白酶酶解制備短肽的方法，為功能性短肽產(chǎn)品的研發(fā)和推廣提供參考。

1 功能性短肽的分類

由于功能性短肽種類繁多、功能各異、來源廣泛。因此，還沒有一套統(tǒng)一的分類標(biāo)準。根據(jù)制備短肽來源的不同，本文將其分為植物蛋白源短肽和動物蛋白源短肽［4］。

1.1 植物蛋白源短肽

1.1.1 大豆短肽 大豆短肽是大豆蛋白經(jīng)過蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵后，再經(jīng)過特殊處理，包括分離、脫色、脫苦等工藝條件而得到的短肽化合物，其通常由3～6個氨基酸分子組成［5］，相對分子量一般在300～1500u之間，同時含有少量游離氨基酸、糖類和無機鹽。大豆短肽還能夠調(diào)節(jié)人體生理功能，例如防治血栓、降血脂、降血壓、抗疲勞、提高機體免疫力、促進微量元素的吸收等［6］。大豆蛋白在蛋白酶的作用下水解成短肽，氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)相近［7］，如表1所示。李志忠［8］等測定了大豆肽產(chǎn)品中短肽質(zhì)量分數(shù)為76.33%，人體所需的8種必需氨基酸的總質(zhì)量分數(shù)為24.94%，游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)約為26.33%，表明大豆肽具有較高的營養(yǎng)價值。最常見的大豆短肽有以下幾種:易消化肽、抗肥胖肽、抗氧化性肽、降血脂肽等。

大豆多肽中具有多種容易消化的短肽，它們主要以低于五肽的形式存在，蛋白質(zhì)經(jīng)過人體消化道酶水解后，主要以短肽的形式吸收，而且比游離的氨基酸更容易吸收。因此，對于那些對蛋白質(zhì)的吸收有困難的人群，例如營養(yǎng)不良、術(shù)后康復(fù)的病人，消化機能衰退的老年人，這類人群所需要的營養(yǎng)可以用大豆多肽來代替。大豆短肽通過降低對食物的吸收而顯現(xiàn)出具有減肥作用的抗肥胖活性，例如大豆球蛋白亞基上的一段短肽片段 Leu－Pro－Tyr－Pro－Arg［9］，可以在足夠能量攝入的基礎(chǔ)上，降低剩余能量成分的吸收，達到減肥降脂的功效。一些大豆短肽具有抗氧化活性，日本學(xué)者用蛋白酶S酶解β－伴大豆球蛋白，從酶解液中分離出六種抗氧化活性肽，其中分子量最小的短肽，Leu－Leu－Pro－His－His，是基于亞油酸氧化作用下，才具有抗氧化活性的［10］。大豆蛋白是一種典型的降膽固醇和血脂的蛋白質(zhì)，大豆蛋白酶解后的短肽不但可以降低膽固醇，還能防止膽汁的重吸收和動脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。韓國學(xué)者星俊祖［12］證明大豆蛋白水解液(SPH)里的短肽具有降低膽固醇的作用，具體機制是大豆水解液中的短肽能夠有效刺激脂蛋白受體(LDL－R)的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)LDL－R轉(zhuǎn)錄可能會增強體內(nèi)分解代謝或減少細胞內(nèi)膽固醇合成。

表1 大豆肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of soybean peptides

1.1.2 小麥短肽 小麥蛋白又叫做“谷朊粉”或“面筋蛋白”，是小麥淀粉的副產(chǎn)物，小麥蛋白質(zhì)含量豐富，可達72%～85%，具有很高的營養(yǎng)價值［13］。小麥蛋白的應(yīng)用可以提高小麥深加工中副產(chǎn)物的利用率，提高小麥產(chǎn)品的附加值。近年來，通過酶解小麥來制備具有生物活性的功能性短肽也成為了研究的熱點。張亞飛［14］等人用堿性蛋白酶水解小麥蛋白所得的小麥肽混合物，經(jīng)過實驗鑒定了小麥肽混合物中含有對小鼠體外淋巴細胞增殖具有刺激作用的活性肽，并具有免疫活性。Wang［15］比較了不同氧化系統(tǒng)作用下的商業(yè)抗氧化劑和用木瓜蛋白酶水解小麥蛋白得到的短肽混合物之間的抗氧化活性的區(qū)別。Matsui［16］等人從小麥胚芽蛋白的水解物中分離出幾種血管緊張素I型轉(zhuǎn)換酶抑制肽，這些短肽對降低血壓有很好的效果。

1.1.3 玉米短肽 與小麥蛋白主要集中在胚芽中不同的是，玉米中的蛋白質(zhì)75%在胚乳中，20%在胚芽中。玉米短肽是玉米蛋白的水解產(chǎn)物，但工業(yè)上制備玉米短肽是以玉米蛋白粉為原料，玉米蛋白粉是從玉米淀粉分離蛋白質(zhì)后得到的不溶于水的濾渣，是淀粉的主要副產(chǎn)物。由于玉米蛋白難溶于水，很大程度上限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用，造成了很大的浪費。玉米蛋白粉主要含有醇溶蛋白，該蛋白中含有較多的支鏈氨基酸和中性氨基酸，因此玉米肽屬于高F值低聚肽。張強［17］以玉米蛋白粉為原料，用堿性蛋白酶水解得到的玉米抗氧化肽對氧離子和氫氧根離子有很強的清除作用，清除率分別達到54%和82%。

1.1.4 花生短肽 花生餅粕是指以脫殼花生果為原料，經(jīng)壓榨提取油以后的副產(chǎn)物，營養(yǎng)價值高，粗蛋白含量30%以上，但花生餅粕很容易感染黃曲霉菌產(chǎn)生黃曲霉素，進而對食品藥品飼料行業(yè)的生產(chǎn)有一定的影響。近年來，科技工作者們對一系列具有抗氧化性、抗真菌［18］、降血壓活性的花生功能性短肽也進行了大量的研究。

1.2 動物蛋白源短肽

動物蛋白源的功能性短肽主要有乳蛋白源短肽、魚蛋白源短肽、肉蛋白源短肽［19］、血蛋白源短肽［20］、蛋源蛋白短肽［21］等，但研究比較深入的是乳蛋白源短肽，是指利用蛋白酶酶解乳蛋白并從酶解液中提取具有各種生物活性的功能短肽。畜禽類乳中含有包含大量酪蛋白、球蛋白、調(diào)節(jié)因子和生長因子，以酪蛋白為主，酪蛋白包括 αs1－酪蛋白、αs2－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白四種類型［22］。其中αs－酪蛋白和β－酪蛋白屬于高度磷酸化的蛋白，β－酪蛋白含有5個磷酸絲氨酸基團。酪蛋白約占到總蛋白80%［23］，其不僅具有營養(yǎng)作用，還具有重要的生理功能。大多數(shù)酪蛋白易受到胃腸道中內(nèi)源性酶的降解，酶解后的短肽一般都具有特殊的生物功能性［24］。按照乳蛋白源短肽的功能和來源大致分為以下三類:

1.2.1 影響免疫系統(tǒng)的乳蛋白源短肽 影響免疫系統(tǒng)的乳蛋白源短肽包括免疫調(diào)節(jié)肽、抗菌肽和抗癌癥肽。酶解乳蛋白、酪蛋白和乳清蛋白，得到具有免疫活性的功能性短肽，可以影響細胞的免疫系統(tǒng)和下游免疫應(yīng)答和細胞功能［25］，使淋巴細胞增殖，促進細胞因子和抗體的合成，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。有臨床科學(xué)家證明，乳蛋白源短肽可以顯著提高人體免疫特性，從而影響人體健康。Jolles［26］等人首次由胰蛋白酶酶解人乳蛋白，得到一段具有免疫活性的多肽鏈，氨基酸序列式 Val－Glu－Pro－Ile－Pro－Tyr，該短肽能夠增強小鼠腹腔中巨噬細胞對綿羊紅細胞的吞噬作用和抗肺炎克氏桿菌的侵染。Migliore－Samour［27］等人發(fā)現(xiàn)酪蛋白源免疫活性肽可以抵抗克雷伯菌屬對大鼠免疫系統(tǒng)的侵入。Otani［28］等人研究發(fā)現(xiàn)小鼠口服血清和免疫球蛋白源短肽可以減輕過敏反應(yīng)，提高消化道粘膜細胞的免疫力。Lopez－Exposito［29］研究了胃蛋白酶消化牛κ－酪蛋白，表明κ－酪蛋白源短肽片段對一些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都具有抗菌作用，并對這些短肽的氨基酸序列進行了分析討論。

1.2.2 影響消化系統(tǒng)的乳蛋白源短肽 影響消化系統(tǒng)的乳蛋白源短肽主要是指酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopetides，CPPs)，酪蛋白磷酸肽是以牛乳蛋白為原料，一般通過胰蛋白酶水解得到的功能性短肽。CPP分子由三十多個氨基酸殘基組成，包含4～7個成簇的磷酸絲氨酸殘基。其能夠有效促進人體吸收二價金屬離子，如鈣離子、鐵離子和鋅離子等，形成可溶性鹽來增加在腸道中的濃度，提高金屬離子的吸收利用率，因此CPP成為了營養(yǎng)保健食品當(dāng)中主要的礦物元素吸收促進劑，能真正達到有效補充人體缺乏的礦物元素的目的。

CPP還具有抗齲齒的功能，乳酪中的CPP能將食物中的鈣離子結(jié)合到牙齒上，減輕牙釉質(zhì)的去礦物化，從而達到抗齲齒的目的［30］。Corss［31］的研究表明，CPP可以穩(wěn)定氯化鈣磷酸鹽可溶性絡(luò)合物，在預(yù)防齲齒和牙釉質(zhì)早期階段的修復(fù)治療方面具有卓越的臨床療效。Yamaguchi［32］在不破壞牙釉質(zhì)的情況下，用超聲波脈沖測定牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的去礦化和再礦化，得出了高濃度的CPP－ACP中的無機成分能夠加強牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的再礦化。

1.2.3 影響神經(jīng)系統(tǒng)的乳蛋白源短肽 阿片肽(opioid peptides)又稱安神麻醉肽或類嗎啡活性肽，是最先在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)激素，因其具有和嗎啡相似的生物效應(yīng)，故叫做類嗎啡肽。可以調(diào)節(jié)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的情緒、呼吸、脈搏和內(nèi)分泌等功能［33］。阿片肽分為內(nèi)源性和外源性兩種，內(nèi)源性阿片肽包含腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽等;外源性阿片肽存在于外源性的食物當(dāng)中，也稱作外啡肽、外援嗎啡或是無激素，其中乳蛋白源的阿片肽是主要的來源［34］。Clare發(fā)現(xiàn)乳蛋白源短肽可以直接作用于神經(jīng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，在牛和人類κ－酪蛋白酶解后的短肽或化學(xué)合成的短肽中，不僅存在阿片肽，還存在與阿片肽相拮抗的物質(zhì)，稱為阿片受體拮抗劑。Chiba［35］化學(xué)合成牛 κ－酪蛋白片段 Tyr－Pro－Ser－Tyr－Gly－Leu－Asn和胰蛋白酶消化得到的序列是Tyr－Pro－Tyr－Tyr的短肽，在豚鼠回腸中均檢測到阿片受體拮抗活性。

乳蛋白源肽還包含一些和谷物蛋白肽相同的功能肽，例如抗高血壓肽、抗血栓肽、以及各種轉(zhuǎn)化生長因子。

2 酶解法制備功能性短肽

多肽的制備方法一般分為化學(xué)水解法、化學(xué)合成法、DNA重組技術(shù)合成法、微生物發(fā)酵法和蛋白質(zhì)酶解法?；瘜W(xué)水解法是采用酸或堿等化學(xué)試劑的作用下，使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂成小分子多肽。該方法簡單易行，但是確有水解純度低、產(chǎn)品質(zhì)量差異大、氨基酸損失大、成本高、試劑毒性大等缺點和難點?；瘜W(xué)合成法雖然能合成具有固定結(jié)構(gòu)和固定生物活性的多肽，但由于合成中毒性大和成本高的原因，在實際生產(chǎn)中很少采用。DNA重組技術(shù)合成法是用基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)合成大分子肽和蛋白質(zhì)，但是近幾年，歐美等國家的消費者都認為基因工程食品或藥品可能對人體有一定的傷害和危險，所以目前使用得比較少。微生物發(fā)酵法制備功能性短肽，由于微生物發(fā)酵機理和代謝途徑較為復(fù)雜，導(dǎo)致發(fā)酵進程不易控制，生產(chǎn)時間長，產(chǎn)品的穩(wěn)定性差。

相對于以上短肽制備方法，蛋白酶酶解法制備短肽具有成本低、安全性好、生產(chǎn)條件溫和、水解容易控制、對設(shè)備條件要求不高、便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，最重要的是因為其沒有有機溶劑殘留和有毒的化學(xué)物質(zhì)［36］，因此工業(yè)上制備功能性短肽較為常用的生產(chǎn)方法是蛋白酶酶解法。本文認為酶解法制備功能性短肽主要包括兩部分內(nèi)容:蛋白酶的選擇和酶解工藝條件的優(yōu)化。

2.1 酶解法中蛋白酶的選擇

在短肽的制備中酶的選擇是關(guān)鍵，不同蛋白酶的活化中心不同，所能水解的蛋白也不同，在短肽的產(chǎn)率、含量和性質(zhì)上存在很大的差異，直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和理化特性。本文根據(jù)蛋白酶來源的不同，把蛋白酶酶解法制備功能性短肽分為植物蛋白酶酶解法、動物蛋白酶酶解法和微生物蛋白酶酶解法。

2.1.1 植物蛋白酶酶解法 植物蛋白酶來源比較廣泛，如劍麻、菠蘿、無花果、獼猴桃、木瓜等都具有高活性的蛋白酶。植物蛋白酶相對于微生物蛋白酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用來說，不需要做毒理實驗和臨床實驗證明酶和多肽有無危害性，可以直接使用。并且植物蛋白酶多是來源于生產(chǎn)的下腳料和副產(chǎn)品。

Yang［37］等用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶在半個小時內(nèi)可以完全水解魚皮明膠，而胰蛋白酶和胰酶完全水解魚皮明膠要兩個小時，可能原因是由于菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶是巰基蛋白酶，而胰蛋白酶和胰酶是絲氨酸蛋白酶。而水解后分子量小于700u的短肽顯著具有抗氧化活性，可以作為食物中的抗氧化劑加以使用。

2.1.2 動物蛋白酶酶解法 動物蛋白酶一般包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧基肽酶等。陳艷輝［38］等人證明動物蛋白酶作為工具酶對牡蠣蛋白質(zhì)進行水解，得到了具有抑制腫瘤細胞生長的活性肽，

該水解產(chǎn)物在分子量小于300u時，多肽能明顯抑制鼻咽癌CNE－1細胞的生長。陳婭嬌［39］用胰蛋白酶水解牛乳蛋白，得到的乳源性抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌都有明顯的抗菌活性，但抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要強于大腸埃希氏菌。Ruiz－Giménez［40］等研究胃蛋白酶酶解牛乳鐵蛋白得到三段降血壓短肽:Arg－Pro－Tyr－Leu、Leu－Ile－Trp－Lys－Leu 和 Leu－Asn－Asn－Ser－Arg－Ala－Pro，均具有 I型血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)依賴的血管收縮抑制作用，數(shù)據(jù)還表明這三段短肽和分子量低于3ku的牛乳鐵蛋白都是有效的降壓復(fù)合物。

2.1.3 微生物蛋白酶酶解法 微生物蛋白酶的菌種來源有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉、毛霉等。其中使用比較廣泛的Alcalase蛋白酶主要是由枯草桿菌蛋白酶A構(gòu)成的一種堿性蛋白酶;Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶是由米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的，蛋白經(jīng)過水解后產(chǎn)生一些疏水氨基酸的苦味肽，風(fēng)味蛋白酶可以把苦味肽降解成氨基酸，從而去除苦味。Wu［41］通過Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白，利用超濾和離子交換樹脂分離血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，其在不同的溫度和pH下均有活性，表明該抑制肽可以抗消化道蛋白酶的水解。鄧靖［42］等研究了曲霉M3蛋白酶水解大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)水解液的水解度隨著水解時間的延長而增大，且在任何水解時間水解液都沒有苦味。

2.2 酶解工藝條件優(yōu)化

酶解法制備短肽的工藝大致是以下流程:物料→水浸泡磨漿或加水溶解→攪拌至充分溶解→調(diào)整溶液pH→預(yù)加熱至酶的適合溫度→加蛋白酶酶解→攪拌反應(yīng)并維持蛋白混合液pH不變→滅酶(沸水或三氯乙酸)→離心過濾→高溫殺菌→冷凍干燥、真空濃縮和噴霧干燥→成品。不同的蛋白酶酶解不同的蛋白制備功能性短肽的工藝條件大有不同，但是主要考察的參數(shù)有酶解溫度、底物濃度、pH、酶解時間、加酶量和料液比等方面。經(jīng)過單因素實驗得到初步工藝條件范圍，再利用各種數(shù)學(xué)計算模型和方法得出最佳的工藝參數(shù)。張淑蓉［43］以酸溶性氮得率作為評價指標(biāo)，用木瓜蛋白酶水解制備南瓜籽仁蛋白多肽，通過正交實驗優(yōu)化酶解條件，酶解液中多肽的酸溶性氮得率為43.52%，抗氧化活性達到Vc的20%以上。潘進權(quán)［44］等人探討了納豆芽孢桿菌蛋白酶對大豆蛋白的水解作用，確定了最佳酶解條件，大豆蛋白水解度達42.385mg/100g，短肽得率為 66.5%。Pedroche［45］用 Alcalase酶解鷹嘴豆蛋白，經(jīng)過凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜純化出四段血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE－inhibitory peptides)，證明其中兩段是ACE競爭性抑制劑，另外兩段是非ACE競爭性抑制劑。

3 展望

由于動植物來源的功能性短肽作為一種新型的蛋白質(zhì)深加工類產(chǎn)品，具有增強人體免疫力、預(yù)防和治療高血壓、抗氧化活性、容易消化吸收等功能特性，短肽類作為功能性食品添加劑和藥品試劑的應(yīng)用前景越來越廣泛。雖然在制備功能性短肽中還存在著一定的問題，但隨著酶解蛋白質(zhì)技術(shù)的發(fā)展和新型酶制劑種類的發(fā)現(xiàn)，將有助于功能性短肽加工制備的技術(shù)升級。我國又是農(nóng)業(yè)大國，蛋白質(zhì)資源種類豐富，短肽類產(chǎn)品的研制和生產(chǎn)如火如荼，有非常好的應(yīng)用前景。同時，隨著對不同來源的功能性短肽進行深入細致研究，會有更多對人體有益的功能被發(fā)掘，將會對食品行業(yè)、功能性保健品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)的開發(fā)壯大有著重要的意義和價值。

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Classification of functional oligopeptides and preparation of enzymatic hydrolysis

LI Hao－jian，YANG Liang－rong*，WEI Xue－tuan，XING Hui－fang，LIU Hui－zhou
(National Key Laboratory of Biochemical Engineering，Key Laboratory of Green Process and Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China)

In recent years，the attention focused on nutritional，functional，physiological activities and applied of the functional oligopeptides derived from proteins was increasing.It had a wide variety of sources，functional oligopeptides could be obtained by appropriate enzymatic hydrolysis，with lowering blood pressure，improving immunity，promoting digestion，antioxidant，neural regulation，anti－bacterial and other biological activity.This paper reviewed the sources and classification，discussed the characteristics of oligopeptides in plant protein source and animal protein source，analyzed enzymatic hydrolysis to prepare peptides by selecting the protease and optimization of enzymatic hydrolysis conditions，it might provide the basis for its depth research and development.

functional oligopeptides;classification;enzymatic hydrolysis;preparation

TS201.1

A

1002－0306(2012)17－0373－05

2012－03－14 *通訊聯(lián)系人

李昊劍(1985－)，男，碩士，研究實習(xí)員，研究方向:食品發(fā)酵工程。

國家自然科學(xué)青年基金(21106162);中國科學(xué)院院地合作項目資助。