切達(dá)干酪發(fā)酵菌種的特性測定及發(fā)酵干酪的評價

陳 雪，王 偉，林 超，楊麗杰

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

切達(dá)干酪發(fā)酵菌種的特性測定及發(fā)酵干酪的評價

陳 雪，王 偉，林 超，楊麗杰*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

對實驗室研究較為成熟的2株乳酸乳球菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)黏測定，同時對其蛋白水解能力進(jìn)行評價;并對單菌株、不同比例組合菌株制備的切達(dá)干酪進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性評價、感官分析和風(fēng)味物質(zhì)測定。測定結(jié)果表明:乳酸乳球菌乳酸亞種KLDS4.0424是主要的產(chǎn)酸菌種;與商業(yè)發(fā)酵劑相比，實驗室菌株的蛋白水解能力和產(chǎn)黏能力相對較弱;乳酸乳球菌乳酸亞種KLDS4.0424與乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326按1∶1接種制作的干酪具有良好的成熟度、質(zhì)地和風(fēng)味，具備開發(fā)成干酪發(fā)酵劑的潛力。

干酪，乳酸乳球菌，發(fā)酵特性

干酪作為“濃縮”的乳制品，營養(yǎng)豐富且易消化，是生物學(xué)價值較高的食品。在西方國家已有上千年的歷史，幾乎是每餐必備的佳品［1］。切達(dá)干酪屬于半硬質(zhì)干酪，是世界干酪生產(chǎn)的主要品種之一，其風(fēng)味溫和、口感適宜，易被中國的消費者接受。目前，開發(fā)可被中國消費者接受的風(fēng)味淡香、口感適宜的干酪，依舊是各大乳制品企業(yè)著力研究的重點。干酪的生產(chǎn)過程中，發(fā)酵劑發(fā)揮著重要的作用，即酸化、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)的形成［2］。現(xiàn)今已涌現(xiàn)出一批具有專業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的知名發(fā)酵劑制造商，例如丹麥Hasen公司和Danisco公司等，它們生產(chǎn)的乳品發(fā)酵劑性狀穩(wěn)定，形態(tài)各異，已成功地應(yīng)用于各種發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。在我國，除西藏的曲拉等傳統(tǒng)干酪產(chǎn)品外，國內(nèi)的干酪生產(chǎn)剛剛起步，生產(chǎn)重心主要停留在再制干酪加工和進(jìn)口產(chǎn)品分裝上［3］。對于干酪發(fā)酵劑的研究仍相對落后，存在的突出問題是菌株的工業(yè)發(fā)酵性能差、活力低、細(xì)胞生物量收獲少，菌體細(xì)胞濃度偏低，這些因素制約著我國干酪發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而干酪直投發(fā)酵劑是國內(nèi)生產(chǎn)干酪的重要原料，目前完全來自進(jìn)口，這限制了我國干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本實驗通過對實驗室研究較為成熟的2株乳酸乳球菌進(jìn)行單菌株、組合菌株發(fā)酵特性測定，并結(jié)合中試生產(chǎn)的切達(dá)干酪質(zhì)構(gòu)、感官評價結(jié)果及風(fēng)味物質(zhì)分布，給出實驗室菌株的特性指標(biāo)以供參考，為菌株開發(fā)成干酪發(fā)酵劑提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌乳酸亞種KLDS4.0424(本文簡稱LA)、乳脂亞種KLDS4.0326(LC)共2株 乳品科學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDSDICC);直投式干酪發(fā)酵劑 丹尼斯克。

鮮奶 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場養(yǎng)殖的荷斯坦奶牛;脫脂乳 德國NORDMILCH AG公司;小牛皺胃酶科漢森。

表1 消費者干酪評價9點喜好尺度法Table 1 Hedonic scale method of measuring cheese preferences

BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實驗設(shè)備有限公司;Bohlin Gemini高級旋轉(zhuǎn)流變儀 英國MALVERN公司;TA.XT－2i型質(zhì)構(gòu)儀 英國stable micro system 公 司;DU800 Nucleic acid/Protein ANALYZER 美國 Beckman coulter公司;Agillent 6890－5973氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱:HP－88 (100m×0.25mm×0.20μm) 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗組編制 實驗組1為單菌株LA，實驗組2為LC，實驗組3為組合菌株(其中LA與LC按比例1∶1接種)、實驗組4為組合菌株按1∶2接種，實驗組5為2∶1接種，對照組為直投式干酪發(fā)酵劑(DSC)。

1.2.2 菌株產(chǎn)酸能力測定 將活化第三代的菌株分別以1%的接種量接種于質(zhì)量濃度為100g/L滅菌脫脂乳中，30℃培養(yǎng)直至凝乳，依據(jù)GB5413.34－2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測定》測定其酸度，計算產(chǎn)酸速率。

1.2.3 菌株產(chǎn)黏能力測定 將活化第三代的菌株分別以1%的接種量接種于質(zhì)量濃度為100g/L滅菌脫脂乳中，30℃培養(yǎng)直至凝乳。采用流變儀測定凝乳后在4℃保存24h的發(fā)酵乳黏度。選取直徑60mm平板，在4℃下測量。

1.2.4 蛋白水解能力測定 取各實驗組相同時間點的發(fā)酵乳，準(zhǔn)確稱取2.50g樣品置于試管，加入1mL雙蒸水混勻，再加入5mL的0.75N三氯乙酸混勻、室溫靜置 10min，5000r/min離心 10min，取上清液330μL與氨基甲酸酯水解試劑OPA混勻，在室溫下反應(yīng)2min，340nm測其吸光度值［4－5］。

1.2.5 切達(dá)干酪的制作 鮮牛乳→進(jìn)行乳成分分析→過濾殺菌→冷卻→添加氯化鈣→接種發(fā)酵劑→產(chǎn)酸→添加凝乳酶→凝乳→切割凝塊→切達(dá)化→凝塊破碎和鹽漬→成型→包裝4℃后熟。

1.2.6 成熟后干酪質(zhì)構(gòu)評價 取成熟90d的干酪樣品，室溫下放置2h，進(jìn)行TPA分析。測量前探頭下降速度為2.0mm/s，測試速度為5.0mm/s，測量后探頭回程速度為2.0mm/s，下壓變形為10mm，觸發(fā)力為0.2N，探頭類型為p/5。

1.2.7 成熟期間干酪風(fēng)味物質(zhì)的分析

1.2.7.1 色譜分析條件 程序升溫條件:初始溫度100℃保持 5min，以 5℃/min升溫至 150℃ 保持5min，以8℃/min升溫至230℃保持15min，總分析時間40min;色譜柱HP－88，進(jìn)樣口250℃，離子源EI，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，載氣He，進(jìn)樣模式不分流進(jìn)樣，流速1mL/min，電離方式EI 70eV，質(zhì)量掃描范圍35～500m/z?；衔锒糠椒?按峰面積歸一化法計算化合物的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.7.2 SPME條件 固相微萃取頭PDMS/DVB/ CARB，萃取頭解析時間1.5min。

1.2.7.3 樣品處理 取樣品50g，萃取頭吸附時間1.5min。

1.2.8 特定人群對干酪喜好度評價 將6組干酪樣品去表皮，在中心區(qū)域取樣5g左右，隨機(jī)編號。隨機(jī)選取10名青年消費者，每個消費者品嘗6種干酪后，根據(jù)各自喜好對不同菌株發(fā)酵干酪進(jìn)行感官描述并排序，采用9點喜好尺度法進(jìn)行打分，打分尺度見表1［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株產(chǎn)酸特性的測定

優(yōu)良干酪發(fā)酵劑菌株的選擇，產(chǎn)酸速度是關(guān)鍵。由表2可以看出:對照組DSC產(chǎn)酸速度最快，單位時間滴定酸度可增加22.3°T;其次是菌株LA，單位時間滴定酸度增加15.0°T;菌株LC產(chǎn)酸速率最低僅為8.1°T/h;三種不同比例組合菌株之間的產(chǎn)酸速率較為接近，均在8～15.0°T/h之間。結(jié)果表明:菌株LA是實驗組發(fā)酵劑的主要產(chǎn)酸菌種，LC的產(chǎn)酸能力相對較弱;實驗組發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能整體遜色于商業(yè)發(fā)酵劑DSC，這可以通過增加接種量或添加可應(yīng)用在干酪生產(chǎn)中的產(chǎn)酸速度較快的菌株彌補(bǔ)不足。有研究表明，發(fā)酵劑菌株產(chǎn)酸緩慢，是導(dǎo)致干酪質(zhì)量差的重要原因之一［2］。凝乳酶的凝乳速度與pH和專一性Ca2+的濃度密切相關(guān)。通常情況下，鮮乳的pH是6.7左右，而凝乳酶的最適pH范圍是5.0～5.5，低酸度環(huán)境還會增加Ca2+的溶解度［7］。因此，在切達(dá)干酪的加工過程中，發(fā)酵劑的一個重要作用是產(chǎn)酸促進(jìn)凝乳并且在干酪的后熟過程中，低pH環(huán)境可有效抑制致病菌和腐敗微生物的生長。

表2 菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸特性Table 2 Acid－producing activity of strains

2.2 菌株產(chǎn)黏特性的測定

在干酪生產(chǎn)過程中選擇產(chǎn)黏適中的菌株是制備優(yōu)質(zhì)干酪的另一關(guān)鍵因素。不同實驗組發(fā)酵質(zhì)量濃度100g/L脫脂乳的黏度結(jié)果如圖1所示，對照組DSC發(fā)酵產(chǎn)黏584.00mPa·s為最大。相比對照組，實驗組的產(chǎn)黏相對較弱，其中單菌株LA黏度值相對較高為 398.35mPa·s，單菌株 LC產(chǎn)黏最低僅為331.90mPa·s。發(fā)酵劑產(chǎn)胞外多糖可增加干酪的持水率，提高干酪的產(chǎn)率，但過多的胞外多糖會導(dǎo)致乳清的排除困難［8］。

表4 干酪TPA質(zhì)構(gòu)特征分析結(jié)果Table 4 Texture profile analysis of cheese

圖1 不同實驗組黏度值Fig.1 The viscosity value of different experimental groups

2.3 菌株蛋白水解能力的測定

發(fā)酵質(zhì)量濃度為100g/L的脫脂乳，菌株蛋白水解能力測定結(jié)果見表3所示，結(jié)果表明:蛋白水解的程度會隨著發(fā)酵時間的增加而增加;其中，對照組發(fā)酵劑DSC的蛋白水解吸光值最大，而且6h后增幅較小，表明:對照組蛋白水解能力最強(qiáng);另外，菌株LA蛋白水解能力強(qiáng)于菌株LC，經(jīng)過24h的發(fā)酵，含有菌株LA的發(fā)酵劑水解能力較為接近，且在不同的時間點增幅較大?？梢赃M(jìn)一步理解為:相同成熟度的干酪，對照組發(fā)酵劑DSC所需的成熟時間最短，實驗組則成熟緩慢，但成熟期間不同時間段干酪品質(zhì)變化會比較明顯，這有利于對苦味多肽的控制。在干酪成熟過程中，發(fā)酵劑分解蛋白質(zhì)為多肽、胨、氨基酸或其它無機(jī)、有機(jī)小分子物質(zhì)，其中不乏必需氨基酸和具有生理作用的活性成分等［9］。這些物質(zhì)極易被人體吸收，提高了干酪營養(yǎng)價值。但產(chǎn)生的某些小分子多肽具有苦味，影響了干酪的口味。篩選蛋白水解能力相對較弱的菌株，可以使干酪在成熟期間產(chǎn)生較少的苦味多肽，使口味柔和，更利于中國消費者接受。

表3 不同時間蛋白水解能力測定結(jié)果Table 3 The results of proteolytic ability in different time

2.4 切達(dá)干酪質(zhì)構(gòu)的評價

質(zhì)構(gòu)是反映干酪成熟期間生化及理化變化的重要指標(biāo)之一［10］。受發(fā)酵劑類型的影響，即使在相同的成熟時間，干酪所表現(xiàn)的質(zhì)地特征也有所不同。干酪TPA質(zhì)構(gòu)特征分析結(jié)果見表4。黏著性最大的為對照組DSC干酪，最小是單菌株LC發(fā)酵干酪，即對照組干酪的粘附程度要高于實驗組，這表明咀嚼該干酪時，干酪對上顎、牙齒等接觸面的黏著性大。含有菌株LA的發(fā)酵劑黏著性差異不大。凝聚性最大的是單菌株LC發(fā)酵干酪，表明咀嚼該干酪時，干酪中酪蛋白抵抗受損并緊密連接的能力最強(qiáng)，干酪保持較好的完整性;咀嚼性最大的是單菌株LA發(fā)酵的干酪，反映了該干酪對咀嚼的持續(xù)抵抗性最強(qiáng)［11］。硬度是硬質(zhì)干酪質(zhì)構(gòu)分析的主要參數(shù)，硬度最大的是單菌株LC發(fā)酵干酪，其數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他實驗組和對照組。這可能是由于干酪制作過程中乳清排除過多，剩余水分較少而引起。這與 Awad［12］等人得出:硬度下降與干酪水分升高有關(guān)的結(jié)論相類似。綜上，實驗組與對照組質(zhì)構(gòu)差異較大，說明在干酪的口感上實驗室發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑還有很大差別。

2.5 切達(dá)干酪風(fēng)味物質(zhì)的測定

干酪成熟期間，發(fā)酵劑菌體會分解代謝碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生具有一定風(fēng)味的有機(jī)和無機(jī)小分子物質(zhì);同時，菌體細(xì)胞出現(xiàn)自溶會釋放出多種胞內(nèi)酶，其中肽酶、蛋白酶等與凝乳酶一起作用分解酪蛋白，使其變成短肽或氨基酸，這些成分直接形成了干酪的風(fēng)味物質(zhì)或是成為特定風(fēng)味物質(zhì)的前體［9］。干酪成熟3個月后產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的主要組成及含量見表5所示。其中組合菌株LA∶LC(1∶1)制作的切達(dá)干酪可檢出的風(fēng)味物質(zhì)明顯多于對照組和其它實驗組。由表5可進(jìn)一步看出:酮、酸及酯類化合物是干酪風(fēng)味的主要來源，其中對干酪特征風(fēng)味組分貢獻(xiàn)最大的化合物有7種，即2－庚酮、2－壬酮、2，3－羥基－2－丁酮、n－葵酸、正十二烷酸、葵酸乙酯和2－十一烷酮。酮類物質(zhì)的風(fēng)味閾值較低，且在干酪樣品中的含量相對較高，整體對干酪的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。其中，3－羥基－2－丁酮賦予了干酪奶香味和脂肪味，這與衣宇佳［13］研究得出的結(jié)論一致。

2.6 切達(dá)干酪特定人群的喜好度評價

青年消費者對6組干酪的喜好度評價結(jié)果見表6所示，消費者對LA單菌株發(fā)酵制備的切達(dá)干酪表示厭惡，對其感官描述為:風(fēng)味刺激、味苦、酸味占主要、沒有奶香味且有臭味。但整體來看，其它實驗組干酪是可以接受的，打分都在5～6之間，感官描述為:口味平淡、略苦、奶油味潔凈。尤其是對照組DSC發(fā)酵制備的切達(dá)干酪奶油味稍重，味香、酸味純正、苦味較淡，感官評定最高為7.2分。組合菌株LALC(1∶1)組合發(fā)酵制備的切達(dá)干酪在實驗組表現(xiàn)突出，但在風(fēng)味和口感上與商業(yè)發(fā)酵劑生產(chǎn)的干酪還有一定的差距。

表5 干酪風(fēng)味物質(zhì)的測定結(jié)果(%) Table 5 The result of flavor composition(%)

表6 切達(dá)干酪特定人群喜好度評價結(jié)果Table 6 Specific populations of cheddar cheese preferences evaluation results

3 結(jié)論

通過對比單菌株、組合菌株發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵特性的差異，結(jié)合實驗組與對照組切達(dá)干酪的質(zhì)構(gòu)、感官評價及風(fēng)味物質(zhì)的測定結(jié)果，表明實驗室開發(fā)的發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑還有一定差距，但其獨特的性質(zhì)可以通過菌株間復(fù)配取長補(bǔ)短。因此，具有開發(fā)成符合中國消費者要求的干酪發(fā)酵劑潛力。其中菌株KLDS4.0424和KLDS4.0326以比例1∶1組合生產(chǎn)的切達(dá)干酪具有良好的成熟度、質(zhì)地和風(fēng)味，值得進(jìn)一步細(xì)化和深入研究。

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Determination of the characteristics of Cheddar cheese fermentation strains and evaluation of fermented cheese

CHEN Xue，WANG Wei，LIN Chao，YANG Li－jie*
(Key Lab of Dairy Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Analysised twolactococcus lactisstrains’fermentation characteristics which included acid－producing ability，extracellular polysaccharide property and proteolytic activity.Texture，flavor components and sensory quality of cheddar cheese which was fermented by single strain and combination withlactococcus lactis sub.lactisKLDS4.0424 andlactococcus lactis sub.cremorisKLDS4.0326 strains were evaluated.All of these strains were researched for a long time in the KLDS.The results showed that KLDS4.0424 was the main acid producing strain.Compared with the commercial starter cultures，the extracellular polysaccharide property and proteolytic activity of laboratory strains were relatively weak.Cheddar cheese had a good maturity，texture and flavor composition which was produced with a ratio of 1∶1 between strain KLDS4.0424 and KLDS4.0326.

cheese;lactococcus lactis;fermentation characteristics

TS252.53

A

1002－0306(2012)21－0074－04

2012－05－03 *通訊聯(lián)系人

陳雪(1987－)，女，碩士研究生，研究方向:乳品科學(xué)與工程。

教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃(IRT0959)。