高壓二氧化碳處理中幾種因素對蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響

廖紅梅，胡小松，廖小軍，*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;

2.國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083;

3.中國農業(yè)大學食品與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

高壓二氧化碳處理中幾種因素對蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響

廖紅梅1，2，胡小松2，3，廖小軍2，3，*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;

2.國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083;

3.中國農業(yè)大學食品與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

主要研究處理介質pH、循環(huán)處理和卸壓速率對高壓二氧化碳處理對蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響。結果表明:在32℃、10MPa和37℃、20MPa下處理30min，通過降低處理介質蘋果濁汁的初始pH能提高殺菌效果;在32～42℃、10～30MPa下以15min為一個周期來循環(huán)處理也能提高殺菌效果，主要是由于循環(huán)處理中因多次升、降壓造成CO2與微生物細胞接觸時間延長，且多次升、降壓提高了CO2滲透入細胞的能力，卸壓速率對HPCD殺菌效果影響不顯著。

高壓二氧化碳，蘋果濁汁，介質pH，循環(huán)處理，卸壓速率

蘋果濁汁是渾濁果汁的典型代表，已經成為國內外蘋果汁加工發(fā)展的重要方向。天然蘋果濁汁中含有許多微生物，易引起腐敗變質，需要通過殺菌來達到保質目的。熱殺菌雖然能夠達到殺菌目的，但容易引起色澤褐變且產生蒸煮味。非熱殺菌在有效殺菌的同時也能保持食品的營養(yǎng)、風味和質構，對于熱敏性食品和功能食品的加工具有良好應用前景。高壓二氧化碳殺菌技術(High pressure carbondioxide，HPCD)是一項新型非熱殺菌技術，并逐漸成為國際學者的研究熱點［1］。據(jù)文獻報道，HPCD早期主要對成分單一的液態(tài)媒介殺菌，包括培養(yǎng)基、緩沖液和生理鹽水。而近年來HPCD逐漸被應用在成分復雜的食品體系，主要有液態(tài)食品，包括果汁(如蘋果汁、橙汁、葡萄汁、椰汁、梨汁、西瓜汁、橘汁和胡蘿卜汁)、牛奶、啤酒和蘋果酒［2－7］。它也應用于固態(tài)食品如紫花苜蓿種子、豬肉、韓國泡菜及菠菜葉［8－11］，較少研究涉及到天然產物如人參粉等［12］。HPCD技術因既能鈍化果蔬汁中內源酶，如果膠甲酯酶［13］、辣根過氧化酶［14］，又能殺滅其中微生物，對于果蔬汁產品品質提高及延長保質期具有巨大潛力。影響HPCD殺菌效果的加工因素主要有壓強、溫度、時間、處理系統(tǒng)、氣體組分、CO2狀態(tài)、卸壓速率、循環(huán)處理、添加劑和攪拌等［1，15］。其中幾乎在所有的文獻中都研究了壓強、溫度和時間對殺菌效果的影響。而對處理介質pH、循環(huán)處理和卸壓速率對HPCD殺菌效果的影響研究較少，為更好地理解HPCD殺菌，本文主要研究這三個因素如何影響HPCD對蘋果濁汁中大腸桿菌(E.coli)的殺菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅富士蘋果 中國農業(yè)大學附近市場，4℃冷庫中貯藏;大腸桿菌 中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，編號為CGMCC 1.90;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和孟加拉培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司;二氧化氯消毒液 北京綠先鋒科技有限公司;二氧化碳，純度為99.5% 北京京城氣體有限公司。

高壓二氧化碳殺菌裝置 中國農業(yè)大學研制，型號CAU－HPCD－1;ZDX－35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP－9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SW－CJ－1FD型無菌操作臺 蘇州尚田潔凈技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果濁汁制備 蘋果經清洗后切成1cm3左右小塊，用榨汁機進行榨汁，用四層紗布過濾除渣，得到蘋果濁汁(pH3.61～3.91，11.5°Bx)。所用蘋果濁汁在121℃下滅菌15min，冷卻后于4℃放置待用。

1.2.2 微生物培養(yǎng) 根據(jù)CGMCC指導書將大腸桿菌的凍干菌粉經過液體營養(yǎng)肉湯(NB)活化兩次以后活力得到復壯，并接種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上2℃保藏。用接種環(huán)接種3環(huán)到100mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)。采用比濁法測定大腸桿菌的生長曲線，確定其達到穩(wěn)定生長初期所需時間。以后每次實驗均培養(yǎng)適當時間以達到其生長穩(wěn)定初期。培養(yǎng)好的菌液接入無菌蘋果濁汁中，其菌濃度為1.03～6.75×107CFU/mL。

1.2.3 HPCD處理 將與反應釜相連的無菌操作臺紫外滅菌30min以上。清洗HPCD設備的反應釜，蓋上反應釜蓋子，密封好后將反應釜用真空泵抽真空，用50mg/L的二氧化氯消毒液浸泡20min，再用無菌水沖洗3遍以上以除去反應釜中殘留的二氧化氯。將反應釜預熱到設定溫度，然后無菌操作將100mL樣品(微生物菌液)泵入反應釜中。經過3～7min的升壓過程達到設定壓強，菌液在恒定的壓強和溫度下進行處理，處理時間達到后，經過約3～10min的卸壓，從與無菌操作臺相連的管道將處理后的樣品放出，用無菌瓶收集。迅速冷卻，檢驗前于4℃下放置，6h內測殘存菌數(shù)。

1.2.4 實驗設計 在循環(huán)處理實驗中，先升壓到預設壓強，保壓15min，立即卸壓作為一個循環(huán)，之后立即升壓進入另一個循環(huán)處理。根據(jù)總處理時間為15、30、45、60、75min分別循環(huán)處理1、2、3、4、5次;在卸壓速率實驗中，通過調節(jié)卸壓閥門控制卸壓速率以檢驗HPCD卸壓速率對殺菌效果的影響。但由于設備條件所限無法監(jiān)測得到CO2流量，故通過卸壓時間分別為3、6、9、12、15min來體現(xiàn)卸壓速率。在研究介質pH對HPCD殺菌效果影響實驗中，采用0.1N NaOH或HCl調節(jié)蘋果濁汁的pH，使其pH在3～8之間，然后再在不同的壓強和溫度條件下進行處理。

1.2.5 微生物數(shù)量測定 采用平板計數(shù)法測定微生物數(shù)目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進行逐級稀釋，根據(jù)細菌數(shù)量選擇合適的稀釋度進行逐級稀釋，吸取連續(xù)3個不同稀釋度的稀釋樣1.0mL于滅菌平皿中，倒入約15mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后在(37±0.1)℃條件下培養(yǎng)24h，并記錄菌數(shù)。

殺菌效果采用殘活率對數(shù)值(LogN/N0)表示，其中:N0為HPCD處理前的初始微生物數(shù)量(CFU/mL); N為HPCD處理后的微生物數(shù)量(CFU/mL)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有實驗均重復三次，數(shù)據(jù)采用方差分析(AOVA)。數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進行統(tǒng)計并繪圖。

2 結果與分析

2.1 循環(huán)處理對HPCD殺菌效果的影響

圖1所示為循環(huán)式脈沖HPCD處理對其殺菌效果的影響。在32℃、10MPa下循環(huán)處理2～3次后殺菌效果沒有顯著變化，但是循環(huán)處理4次以上則殺菌效果顯著提高。在37℃、20MPa條件下，經過循環(huán)處理后HPCD殺菌效果顯著提高，循環(huán)處理2次后殺菌效果提高1.4對數(shù)。在42℃、30MPa條件下，隨著處理時間延長，循環(huán)處理與普通HPCD處理之間的殺菌效果差異越來越小，在75min時兩者完全重合，達到完全滅菌。隨著壓強和溫度升高、處理時間延長，循環(huán)處理與普通HPCD處理之間的殺菌效果差異呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢，這與HPCD的殺菌效果不是僅由一個因素控制有關。在處理強度較低時，循環(huán)處理能夠逐漸體現(xiàn)其殺菌優(yōu)勢;但是隨著殺菌強度逐漸提高，其他因素如壓強、溫度等成為殺菌的主導因素。在前人的研究結果中推測由于多次升、降壓對微生物細胞造成的“爆破”效應，導致細胞破裂而亡，進而提高殺菌效果。通過掃描電鏡對37℃、10MPa處理30min的大腸桿菌細胞進行檢測，結果如圖2所示。即使在30min內將循環(huán)次數(shù)提高到3次對大腸桿菌細胞結構、完整性也沒有造成顯著影響。由此可見，循環(huán)處理提高殺菌效果是由于CO2與微生物細胞接觸時間延長(由于多次升、降壓造成)，且多次升、降壓提高了CO2滲透入細胞的能力造成。

2.2 卸壓速率對HPCD殺菌效果的影響

如圖3所示，在卸壓時間分別為 3、6、9、12、15min條件下HPCD殺菌效果有所波動，但是差異并不顯著(p＞0.05)，說明卸壓速率對殺菌效果影響不大。在HPCD早期研究中，一些研究者認為快速降壓是一個增加破壞細菌細胞的因素［16－18］。Liu等［19］得出在7.5MPa，30℃處理30或90min使釀酒酵母以及藍色犁頭霉孢子的生存能力和生物活性顯著受到CO2卸壓速率的影響。但是這一理論卻被其他研究者所質疑［20－21］:Arreola等［21］在快速卸壓實驗初期收集了大量完整細胞;Enomoto等［20］將釀酒酵母在

圖1 循環(huán)式HPCD處理對蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響Fig.1 Effect of cycling－pulsed HPCD treatment on inactivation of E.coli in cloudy apple juice

圖2 HPCD與循環(huán)式HPCD處理后大腸桿菌的SEM圖Fig.2 The SEM images of E.coli as exposed to HPCD and cycling－pulsed HPCD treatment

4.0MPa、40℃處理240min后采取快速降壓和慢速降壓兩種不同方式，結果表明，加快卸壓速率并不一定提高殺菌效果，這表明微生物細胞的破裂并不主要是由于突然卸壓所致。因此，HPCD殺菌主要在保壓階段，而非快速卸壓階段。

圖3 不同卸壓速率下HPCD對蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果影響Fig.3 Effect of depressure rate on inactivation of Escherichia coli in cloudy apple juice

2.3 處理介質pH對HPCD殺菌效果的影響

圖4所示為32℃、10MPa和37℃、20MPa條件下HPCD不同pH對蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果。隨著pH增加(由酸性到堿性)，HPCD對大腸桿菌的殺菌效果逐漸降低。在32℃、10MPa條件下處理30min，當pH由3.08升高到8.18時，大腸桿菌活菌數(shù)分別降低了4.69和0.62個對數(shù)值。在不同pH條件下，HPCD對大腸桿菌的殺菌效果在37℃、20MPa較在32℃、10MPa差異更不顯著，說明在較高壓強和溫度條件下pH對HPCD的殺菌效果影響更不顯著。Damar等［15］認為處理介質的初始pH對HPCD的殺菌效果具有重要影響。Lindsay［22］認為碳酸像其他帶有羧基的酸一樣在低pH環(huán)境下更容易滲透過細胞膜，因此能提高殺菌效果。Hong等［23］報道 HPCD (6.8MPa、30℃)處理醋酸鹽緩沖液(pH4.5)、無菌水(pH6.0)和磷酸緩沖液(pH7.0)中植物乳桿菌達到降低5個對數(shù)值所需要的時間分別為25、35、60min。但Haas［24］認為將處理介質用磷酸或鹽酸酸化并不能達到與CO2一致的殺菌效果，并推測這種現(xiàn)象可能與這些有機酸并不能像CO2那樣容易地穿過細胞膜有關。另外Wei等［25］在李斯特菌懸浮液中通過添加0.1N HCl使得pH降低1.8個單位，在6.18MPa條件下處理2h能夠達到相同的酸化效果，但是前者沒有殺菌效果而HPCD則能達到完全滅菌。因而可以說明，處理介質的pH對HPCD殺菌效果具有重要影響，但是介質pH環(huán)境并不是微生物細胞死亡的關鍵因素，CO2在HPCD殺菌過程中起著主導作用。

圖4 HPCD在不同pH條件下對蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果Fig.4 Effect of pH of suspension on inactivation of E.coli in cloudy apple juice exposed to HPCD

3 結論

HPCD對蘋果汁中大腸桿菌具有較好的殺菌效果;降低處理介質初始pH、循環(huán)處理均能提高殺菌效果;卸壓速率對HPCD殺菌效果影響不大。因而，在HPCD殺菌過程可以通過降低初始pH，或進行循環(huán)處理來提高殺菌效果及縮短處理時間。

4 展望

從本研究中可以看出，通過42℃、30MPa處理45min后，HPCD對蘋果汁中大腸桿菌達到降低5個對數(shù)的要求，也即達到美國FDA對果蔬汁中微生物降低5個對數(shù)的要求，但是處理時間較長，因而在今后的研究中需要進一步優(yōu)化實驗條件，或者與天然抑菌劑相結合，以達到快速有效殺菌的目的。

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Influence of several factors on the survival ofEscherichia coliin cloudy apple juice as subjected to high pressure carbon dioxide

LIAO Hong－mei1，2，HU Xiao－song2，3，LIAO Xiao－jun2，3，*
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;
2.National Fruit and Vegetable Processing Technology Center，Beijing 100083，China;
3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

The influence of initial suspending pH，circle treatment and depressurization rate on the survival of Escherichia coli(E.coli)in cloudy apple juice as subjected to High pressure carbon dioxide(HPCD)were analyzed.The results revealed that the inactivation efficacy increased as decreasing the initial suspending pH asE.coliexposed to HPCD at 32℃and 10MPa，37℃ and 20MPa for 30min.The inactivation efficacy was also increased by circle treatment per each 15min at 32～42℃and 10～30MPa，which might due to enhancement of solubilization of CO2and its contact with bacterial cells during circle treatment by pressurization and rapid depressurization for several times.The decompression rate did not influence the inactivation efficacy significantly in this study.

high pressure carbon dioxide;cloudy apple juice;initialsuspending pH;circle treatment; depressurization rate

TS201.1

A

1002－0306(2012)21－0066－04

2012－05－04 *通訊聯(lián)系人

廖紅梅(1983－)，女，博士，講師，主要從事食品非熱加工技術方面研究。

國家自然科學基金(31101360);教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET－06－0109);江南大學基本科研業(yè)務基金(JUSRP11123)。