超速起搏預(yù)適應(yīng)的延遲保護(hù)作用與環(huán)氧化酶2表達(dá)的關(guān)系

徐玲 陳國楨

缺血性心臟病是嚴(yán)重危及人類健康的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在研究過程中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到激發(fā)和扶持機(jī)體內(nèi)源性抗損傷能力是細(xì)胞保護(hù)的最有效措施，并成為當(dāng)前細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的重要內(nèi)容。Murry等［1］于1986年從犬的實(shí)驗(yàn)中首先提出了缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)的概念，目前大量研

究顯示，心肌IPC的延遲保護(hù)作用主要與炎癥時(shí)產(chǎn)生的介質(zhì)及新生蛋白質(zhì)的合成有關(guān)［2］。環(huán)氧化酶2(COX-2)mRNA在正常心臟上幾乎檢測(cè)不到［3］，但發(fā)現(xiàn)COX-2基因敲除的小鼠心肌發(fā)生了明顯的纖維化［4］，提示COX-2可能具有維持正常心肌功能的作用。放線菌素D又稱更生霉素，可阻礙COX-2的生成。預(yù)適應(yīng)的誘導(dǎo)方法具有多樣性，一次或多次短暫缺血再灌注是啟動(dòng)預(yù)適應(yīng)的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)采用快速起搏右心室的方法，同時(shí)檢測(cè)COX-2的表達(dá)情況，從而探討預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用和COX-2的關(guān)系，為臨床治療缺血性心肌病和保護(hù)心肌提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的新西蘭雄兔24只，由上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［動(dòng)物合格證號(hào):0013964，許可證號(hào):SCXK(滬)2002-0011］，體質(zhì)量 2.2 ～2.8 kg，平均(2.5±0.2)kg。

1.1.2 儀器 心電監(jiān)護(hù)儀(Hewlett-Packard GmbH，德國)，5F雙極臨時(shí)起搏電極(美國St.Jude Medical Inc)，DF-5A心臟電生理刺激儀(蘇州工業(yè)園區(qū)東方電子儀器廠)，XD-7300心電圖機(jī)(上海醫(yī)療器械技術(shù)公司)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)，放線菌素D(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，山羊抗兔、大鼠、小鼠等COX-2的多克隆抗體(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 新西蘭雄兔24只，隨機(jī)分成3組:(1)單純結(jié)扎組:經(jīng)耳緣靜脈穿刺靜脈留置針，建立靜脈通道，并用稀釋的肝素(1∶100 U)沖管，用2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg緩慢靜脈注入，麻醉后觀察兔的呼吸、心率以及對(duì)刺激的反應(yīng)，待麻醉完全后，四肢備皮，接心電監(jiān)護(hù)儀和心電圖機(jī)，頸部備皮，消毒鋪巾，頸部皮膚正中切開，分離右側(cè)頸靜脈并插A鞘管，5F起搏電極經(jīng)動(dòng)脈鞘管插入，送入右心室，高于基礎(chǔ)心率20次/min起搏10 s，描記起搏時(shí)體表心電圖，證實(shí)已經(jīng)到達(dá)心室70 min后取出置管。結(jié)扎右頸靜脈，80萬U青霉素鈉局部預(yù)防抗感染，縫合皮膚后放回動(dòng)物室繼續(xù)飼養(yǎng)。(2)起搏組:同單純結(jié)扎組置管后，以500次/min起搏右心室10 min×4次(間歇5 min)，此后同單純結(jié)扎組。(3)起搏+放線菌素D組:動(dòng)物麻醉后靜脈注射放線菌素D 0.1 mg/kg，起搏電極經(jīng)動(dòng)脈鞘管插入，送入右心室起搏完畢后，余同起搏組。

1.2.2 模型建立 24 h后各組重新麻醉，胸前區(qū)備皮，頸內(nèi)靜脈注射500 U/kg肝素抗凝。四肢接心電監(jiān)護(hù)儀和心電圖機(jī)，頸部消毒鋪巾，剪開頸部縫線，分離右側(cè)頸靜脈，并頸總靜脈插管送入右心室，以備采血。氣管切開，插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù):呼吸比1∶1，呼吸頻率40次/min，潮氣量按10 ml/kg計(jì)算。胸前區(qū)消毒鋪巾，沿胸骨左緣2、3、4肋剪開胸骨表面皮膚，剪斷胸骨左緣2、3、4肋，盡量不損傷胸膜，剪開心包，暴露心臟，在冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處，用4.0絲線穿過淺層心肌，其末端套一外徑為2 mm的聚氯乙烯管，通過拉緊絲線阻斷冠狀動(dòng)脈血流，用動(dòng)脈夾擠壓聚乙烯管，此時(shí)心臟表面出現(xiàn)青紫，造成心肌缺血(ST段明顯抬高，缺血區(qū)域心肌顏色變?yōu)榛野当硎居行?，松開絲線即可恢復(fù)灌流，穿線結(jié)扎20 min，松線后再灌注60 min，再灌注30 min時(shí)觀察有無心律失常，若無心律失常，用臨時(shí)起搏電極于心室表面刺激10 s，觀察有無誘發(fā)心律失常，再灌注60 min時(shí)同前操作誘發(fā)心律失常，并連續(xù)記錄心律失常情況。

1.2.3 標(biāo)本采集 (1)分別于結(jié)扎前10 min，結(jié)扎后20 min、再灌注30 min、再灌注60 min時(shí)取血，以檢查肌酸激酶(CK)和CK同工酶(CK-MB)，于離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/min離心2次，取上清液置于－80℃中保存待測(cè)。(2)再灌注60 min后立即處死新西蘭兔，取出左心室缺血區(qū)和結(jié)扎線上的心肌組織各一塊，約5 mm×5 mm×5 mm大小，10%中性甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋。所有切片均隨機(jī)盲法下讀片，并由我院病理科相關(guān)專業(yè)人員復(fù)核并確認(rèn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組CK、CK-MB水平比較

3組實(shí)驗(yàn)兔冠狀動(dòng)脈缺血前的血清CK和CK-MB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05);缺血后再灌注0 min、30 min、60 min的血清 CK和 CK-MB水平明顯較缺血前升高，且隨時(shí)間變化有逐漸升高的趨勢(shì)，單純結(jié)扎組升高最為明顯，起搏組上升最小，起搏+放線菌素D組介于二者中間，見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔缺血再灌注前后血清CK和CK-MB的變化(，IU/L)

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔缺血再灌注前后血清CK和CK-MB的變化(，IU/L)

注:缺血后3組比較，均為P＜0.01

組別 只數(shù)CK CK-MB單純結(jié)扎8缺血前 900±319 120± 55再灌注0 min 2625±423 1332±178再灌注30 min 3202±712 1535±142再灌注60 min 3723±735 1709±163起搏 8缺血前 800±266 121± 48再灌注0 min 1492±474 614±182再灌注30 min 1760±458 756±114再灌注60 min 2163±602 904±149起搏+放線菌素D 8缺血前 839±179 114± 38再灌注0 min 2071±390 1095±183再灌注30 min 2521±423 1208±193再灌注60 min 2896±430 1376±274

2.2 心律失常的誘發(fā)情況

單純結(jié)扎組和起搏+放線菌素D組的實(shí)驗(yàn)兔在缺血再灌注后自發(fā)或經(jīng)刺激后誘發(fā)出現(xiàn)惡性心律失常，包括頻發(fā)期前收縮、室性心動(dòng)過速、房室傳導(dǎo)阻滯、心室顫動(dòng)等，體表心電圖如圖1～3所示。單純結(jié)扎組再灌注過程中發(fā)生心律失常的實(shí)驗(yàn)兔共有5只，起搏+放線菌素D組有4只，起搏組無心律失常發(fā)生。三者之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)，起搏組與單純結(jié)扎組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)，由此可知快速起搏干預(yù)后有減少心律失常發(fā)生的趨勢(shì)，起搏+放線菌素D組與單純結(jié)扎組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 COX-2的表達(dá)情況

圖4A取自起搏組左心室結(jié)扎線上、下的心肌組織，心肌細(xì)胞胞漿和胞核均染成棕褐色，染色深;圖4B取自起搏+放線菌素D組左心室結(jié)扎線上、下的心肌組織，心肌細(xì)胞胞漿和胞核部分染成淺黃色;圖4C取自單純結(jié)扎組左心室結(jié)扎線上、下的心肌組織，心肌細(xì)胞胞漿和胞核無明顯染色。

各組結(jié)扎線上和結(jié)扎線下COX-2的陽性表達(dá)情況見表2，結(jié)果分為4個(gè)層次:0～1分為“－”，2～3分為“+”，4～6分為“++”，7～9分為“+++”。部位表達(dá)廣泛，結(jié)扎線上、下的心肌均有表達(dá)，3組實(shí)驗(yàn)兔結(jié)扎線上和結(jié)扎線下陽性表達(dá)程度秩和檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 3組實(shí)驗(yàn)兔心肌組織結(jié)扎線上、下COX-2表達(dá)陽性染色水平的比較

3 討論

缺血心肌保護(hù)一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，80年代以來，心肌保護(hù)的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向細(xì)胞保護(hù)，即增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧等損傷的抵抗力。自從1986年Murry等首先提出IPC的概念后，近年來對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。對(duì)預(yù)適應(yīng)模型的建立也進(jìn)行了廣泛的探討。預(yù)適應(yīng)方法有很多種，各具有一定優(yōu)點(diǎn)和局限性，人們一直在探索更有臨床實(shí)用價(jià)值的預(yù)適應(yīng)方法。Vegh等［5］1991年提出超速起搏預(yù)適應(yīng)概念，即通過快速起搏造成心肌短暫的供血減少，同時(shí)增加氧耗，使心臟發(fā)生相對(duì)缺血，進(jìn)而對(duì)后續(xù)的長期缺血產(chǎn)生保護(hù)。該方法消除了IPC本身短暫缺血的致心律失常作用，常用于研究預(yù)適應(yīng)對(duì)心律失常的保護(hù)作用，但對(duì)于如何具體建立超速起搏的模型，目前尚未統(tǒng)一。

本實(shí)驗(yàn)中，兔經(jīng)開胸暴露心臟，通過拉緊絲線以阻斷冠狀動(dòng)脈血流，心肌表面隨即變成青紫色，缺血后體表心電圖ST段呈弓背向上抬高的動(dòng)態(tài)改變，松線后心肌表面又恢復(fù)紅潤。提示穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈缺血再灌注模型建立成功。

心肌缺血時(shí)能量代謝發(fā)生障礙，乳酸、脂肪酸、脂酰輔酶A等酸性代謝產(chǎn)物蓄積，持久的心肌缺血可發(fā)生不可逆性損傷，大分子的酶釋放入血，如血中CK和CK-MB升高。由于CK和CK-MB檢測(cè)方便、快捷、價(jià)格低廉，許多實(shí)驗(yàn)都以CK和CK-MB作為心肌損傷嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可大致反映心肌受損的程度。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的缺血再灌注模型的建立方法，開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，結(jié)扎前10 min，3組兔的CK和CK-MB處于同一水平，3組之間相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可知，3組兔24 h前經(jīng)過不同的干預(yù)因素如超速起搏和放線菌素D，對(duì)其心肌損傷無明顯影響，而缺血后CK和CK-MB較缺血前有顯著的上升，提示隨時(shí)間變化逐漸上升的趨勢(shì)，符合心肌急性缺血的改變，伴再灌注心律失常出現(xiàn)，反過來又支持了缺血再灌注模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)過程中也存在不足之處，如未采用反映心肌損傷更為直觀的電鏡檢查和采用靈敏度較高的肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)檢測(cè)，有待今后進(jìn)一步改進(jìn)并行深入的研究。

預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用主要涉及以下3個(gè)方面:減輕心肌壞死、減少惡性心律失常的發(fā)生及促進(jìn)心肌功能恢復(fù)。(1)減輕心肌壞死:目前已證實(shí)，IPC可以減少細(xì)胞損傷，縮小心肌梗死面積，這一強(qiáng)大作用是目前任何藥物所無法比擬的。(2)減少惡性心律失常的發(fā)生:1987 年，Shiki和 Hearse［6］首次報(bào)道IPC降低大鼠缺血后惡性心律失常的發(fā)生，隨后Wu等［7］通過臨床研究進(jìn)一步表明，IPC可以明顯減少冠狀動(dòng)脈多支病變經(jīng)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng)的發(fā)生率。國內(nèi)學(xué)者吳棘等［8］用快速起搏心房也能明顯降低缺血再灌注后心律失常的發(fā)生率和致死率。(3)改善心肌功能:IPC可以明顯改善缺血再灌后心肌收縮及舒張功能，提高左心室收縮功能，增強(qiáng)心肌的收縮力。本實(shí)驗(yàn)通過快速起搏法研究預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象的保護(hù)作用，觀察到起搏組再灌注不同時(shí)相CK和CK-MB的升高都明顯低于單純結(jié)扎組，惡性心律失常的發(fā)生率也低于對(duì)照組，而CK和CK-MB是心肌損傷或壞死時(shí)釋放入血，由此可知超速起搏兔右心室后，兔心肌產(chǎn)生對(duì)缺血再灌注損傷的耐受，使心肌損傷減少，頻發(fā)室性期前收縮、室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng)等惡性心律失常也明顯減少。由于心律失常的發(fā)生與缺血再灌注引起的心肌胞質(zhì)Ca2+超載有關(guān)，故吳棘等［8］推測(cè)超速起搏預(yù)適應(yīng)的抗心律失常作用可能是通過減少心肌損傷，減輕了細(xì)胞質(zhì)膜的功能障礙，進(jìn)而減輕了胞質(zhì)內(nèi)Ca2+超載而實(shí)現(xiàn)的。最近有報(bào)道，預(yù)適應(yīng)的抗心律失常由緩激肽(bradykinin)介導(dǎo)，通過激發(fā)ATP敏感性K通道，發(fā)揮抗心律失常作用［9］，但緩激肽、ATP敏感性K通道和效應(yīng)蛋白等聯(lián)系起來，值得進(jìn)一步探討，所以快速起搏預(yù)適應(yīng)方法可以模擬經(jīng)典的缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)觀察到了三大保護(hù)作用中的前面兩大方面，由于條件有限未能監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)方面的變化，是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。

免疫印跡分析顯示，缺氧時(shí)(1%O2)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞COX-2蛋白增加4倍以上，Northern blot和RT2PCR均顯示，COX-2mRNA水平相應(yīng)增加［10］。在兔實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，COX-2介導(dǎo)了缺血預(yù)處理的延遲性心肌保護(hù)作用［11］。缺氧在不依賴于其他刺激物的情況下可使培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞COX-2基因表達(dá)增加。心肌短暫缺血時(shí)，可引發(fā)大量的血管活性物質(zhì)從冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和(或)心肌細(xì)胞釋放，其中緩激肽被認(rèn)為是參與IPC心肌保護(hù)作用的主要活性物質(zhì)。研究報(bào)道，在長時(shí)間缺血后的再灌注早期給予外源性緩激肽，可縮小心肌梗死面積［12］。有研究證實(shí)整體給藥24 h后，在大鼠離體心臟缺血缺氧復(fù)灌模型上，緩激肽能誘發(fā)24 h后的心臟晚期保護(hù)效應(yīng)［13］。COX-2的抑制劑可消除緩激肽預(yù)處理的晚期心肌保護(hù)作用，提示COX-2可能作為緩激肽的下游參與其誘導(dǎo)的晚期心肌保護(hù)作用。在體內(nèi)花生四烯酸代謝過程中最主要的限速酶COX-2被證實(shí)是一種誘導(dǎo)型酶，其表達(dá)受多種刺激因素，如細(xì)胞因子、生長因子、佛波酯等所誘導(dǎo)。Bolli等［14］在兔的缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，缺血后24 h即有COX-2蛋白及其代謝產(chǎn)物增加，認(rèn)為COX-2表達(dá)及活性上調(diào)，對(duì)于預(yù)適應(yīng)晚期的心肌頓抑和心肌梗死具有保護(hù)作用，而COX-2抑制劑可使這種保護(hù)作用完全喪失。

因此，我們可以推斷COX-2是心肌缺血預(yù)處理的保護(hù)性蛋白，當(dāng)然不排除心肌受其他刺激也可增加COX-2的表達(dá)。但這些都有待進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation，1986，74:1124-1136.

［2］Rizvi A，Tang XL，Qiu Y，et al.Increased protein synthesis is necessary for the development of late preconditioning against myocardial stunning.Am J Physiol Heart Circ Physiol，1999，277:H874-H884.

［3］Liu SF，Newton R，Evans TW，et al.Differential regulation of cyclo-oxygenase-1 and cyclo-oxygenase-2 gene expression by lipopolysaccharide treatment in vivo in the rat.Clin Sci(Lond)，1996，90:301-306.

［4］Liang BT，Gross GJ.Dieret Preconditioning of cardiac myoeytes via opioid Rerceptors and KATP channels.Cire Res，1999，84:1396-1400.

［5］Vegh A，Szekeres L，Parratt JR.Transient ischaemia induced by rapid cardiac pacing results in myocardial preconditioning.Cardiovasc Res，1991，25:1051-1053.

［6］Shiki K，Hearse DJ.Preconditioning of ischemic myocardium:reperfusion induced arrhythmias.Am J Physiol，1987，253:H1470-H1476.

［7］Wu ZK，Iivainen T，Pehkonen E，et al.Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization.Circulation，2002，106:3091-3096.

［8］Wu J，Li ZA，HeY.Experimental study on protection of preconditioning induced by rapid atrailpacing againstthe ventricular arrhythmias following ischemia and reperfusinon.Journal of Guangxi Medical University，2004，21:39-41.吳棘，李治安，何云.快速起搏預(yù)適應(yīng)減少缺血再灌注所致心律失常的實(shí)驗(yàn)研究.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21:39-41.

［9］Driamov SV，Bellahcene M，Butz S，et al.Bradykinin is a mediator，but unlikely a trigger，of antiarrhythmic effects of ischemic preconditioning.J Cardiovasc Electrophysiol，2007，18:93-99.

［10］Bell RM，Yellon DM. Bradykinin limits infarction when administered as an adjunct to reperfusion in mouse heart:the role of PI3K，Akt and eNOS.J Mol Cell Cardiol，2003，35:185-193.

［11］Schmedt JR， JiYS， Liu WL， etal. Hypoxia induces cyclooxygenase-2 via the NF-kappa Bp65 transcription factor in human vascular endothelial cells.J Biol Chem，1997，272:601-608.

［11］Guo Y，Bao W，Wu WJ，et al.Evidence for an essential role of cyclooxygenase-2 as a mediator of the late phase of ischemic preconditioning in mice.Basic Res Cardiol，2000，95:479-484.

［12］Monnet X，Lucats L，Colin P，et al.Reduction in postsystolic wall thickening during late preconditioning.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292:H158-H164.

［13］Dong HZ，Chen YY，Zhu L，et al.COX-2 and HO-1 are involved in the delayed preconditioning elicited by bradykinin in rat hearts.Journal of Zhejiang University(Medical Sciences).2007，50:13-20.董海正，陳瑩瑩，朱立，等.COX-2和HO-1參與緩激肽誘發(fā)的晚期心肌保護(hù)作用.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，50:13-20.

［14］Bolli R，Shinmura K，Tang XL，et al.Discovery of a new function of cyclooxygenase (COX)-2: COX-2 is a cardioprotective protein that alleviates ischemia/reperfusion injury and mediates the late phase of preconditioning.Cardiovasc Res，2002，55:506-519.