硫酸軟骨素酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究＊

劉萬順，付靜蕓，常 菁，楊 艷，韓寶芹

（中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003）

硫酸軟骨素酶（Chondroitinase）能特異地降解硫酸軟骨素為不飽和二糖及寡糖，硫酸軟骨素酶有多種重要用途，在基礎(chǔ)研究中它用來構(gòu)建二糖和寡糖的基因文庫［1］，用來研究糖胺多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)［2］。近年來，該酶在臨床領(lǐng)域的研究非常活躍，包括對細(xì)胞外基質(zhì)代謝相關(guān)疾病，如大骨節(jié)病的防治［3］，對糖胺多糖與腫瘤等疾病發(fā)生關(guān)系的研究［4］，阻止玻璃體與視網(wǎng)膜的粘連［5］，促進(jìn)神經(jīng)軸的再生［6］以及增強(qiáng)軟骨細(xì)胞與軟骨的粘附力［7］等。因此，對硫酸軟骨素酶的分離純化具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

微生物是硫酸軟骨素酶的主要來源，國外主要從微生物中提取硫酸軟骨素酶來獲得高純度的酶制劑，已報(bào)道的產(chǎn)酶菌株主要有普通變形桿菌（Proteus vulgaris）［8］，肝 素 黃 桿 菌 （Flavobacterium heparinum）［9］，奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）［10］等。目前國內(nèi)沒有硫酸軟骨素酶產(chǎn)品供應(yīng)，全部依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴。本文分離到產(chǎn)硫酸軟骨酶活力較高的菌株，對該菌進(jìn)行了初步鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，以期為發(fā)酵制備硫酸軟骨素酶奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

硫酸軟骨素為市售食品級，其余試劑均為國產(chǎn)分析純商品試劑。

1.2 培養(yǎng)基

（1）平板分離培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基（%，w／v）（NH4）2SO41，硫酸軟骨素 0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，瓊脂2，其余為水，調(diào)pH 至7.0。

（2）初篩培養(yǎng)基（%，w／v） 平板分離培養(yǎng)基＋Albumin bovine V（牛血清白蛋白第五組份）1，調(diào)pH至7.0。

（3）復(fù)篩培養(yǎng)基（%，w／v） 硫酸軟骨素0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，MgSO4·7H2O 0.5，以（NH4）2SO41或NaNO31或蛋白胨1或酵母粉1或牛肉膏1為氮源，其余為水，調(diào)pH至7.0。

（4）液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基（%，w／v） 蛋白胨1，硫酸軟骨素0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，MgSO4·7H2O 0.5，其余為水，調(diào)pH 至7.0。

1.3 產(chǎn)酶菌株的篩選

1.3.1 初篩 將采集到的土樣用無菌水進(jìn)行懸浮并稀釋，涂布平板分離培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～4d，劃線法將得到的單菌落在平板分離培養(yǎng)基上進(jìn)行純化；參照文獻(xiàn)［11］，純化后的單菌落轉(zhuǎn)接到初篩培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～4d后，向平板表面倒入5mL 2mol／L的冰醋酸，觀察有無透明圈，高分子量的硫酸軟骨素具有大量的負(fù)電荷，可與小牛血清第五組分結(jié)合形成能與冰醋酸混合發(fā)生濁度反應(yīng)的復(fù)合物，硫酸軟骨素酶則會(huì)使復(fù)合物中硫酸軟骨素降解，形成透明圈，因此有透明圈則說明有硫酸軟骨素酶活性，然后把篩選得到的有透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上保存。

1.3.2 復(fù)篩 挑取新鮮斜面種子一環(huán)接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃130r／min搖床培養(yǎng)24h，菌體密度經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)為（2～3）×107個(gè)／mL（以下種子菌液同），以2.0%的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)72h，發(fā)酵液經(jīng)6 000r／min離心10min，取上清液測酶活，每12h測一次。

1.4 酶活力的測定

參照Saito.H［2］的方法進(jìn)行酶活力的測定。取0.1mL離心的發(fā)酵上清液、3.9mL 0.02mol／L Tris－HCl（pH＝7.5）和4mL 0.2%硫酸軟骨素，加入比色管中，37℃水浴反應(yīng)20min后，立即置于沸水浴中煮沸5min，對照管以相同的條件加入滅活的發(fā)酵上清液，在232nm處測定光吸收值。蛋白質(zhì)含量的測定采用Lowry法。

酶的活力單位U定義為37℃條件下，每分鐘催化形成1μmol不飽和雙糖的酶量。相對酶活（%）是指在單因子發(fā)酵產(chǎn)酶影響試驗(yàn)中，該因子各水平發(fā)酵液的酶活力與該因子最高產(chǎn)酶水平發(fā)酵液的酶活力的比值。酶活力單位的計(jì)算公式為：

式中：A指232nm處不飽和二糖的吸光值；ε指毫摩爾消光系數(shù)，一般是5.1；d指所用石英比色皿的厚度，一般是1cm；t指反應(yīng)的時(shí)間（min）；Vt指反應(yīng)的總體積（mL）；Vs指樣品的體積（mL）。

1.5 產(chǎn)酶菌株的鑒定

將復(fù)篩得到的產(chǎn)硫酸軟骨素酶活力高的菌株進(jìn)行形態(tài)、革蘭氏染色等常規(guī)檢查，并選用純化培養(yǎng)物，利用法國梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2的API 20NE手工編碼鑒定進(jìn)行生理生化特性考察。

1.6 菌株生長曲線的測定

將新鮮斜面種子挑取一環(huán)接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃，130r／min搖床培養(yǎng)24h作為種子菌液，然后以2.0%的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃，130r／min搖床培養(yǎng)，每隔12h取樣測定580nm處的OD580，繪制生長曲線。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究［12－13］

1.7.1 最適碳源的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以1.0%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖或可溶性淀粉代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸軟骨素作為碳源，按2.0%的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)不同碳源對產(chǎn)酶的影響。

1.7.2 最適氮源的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以1.0%尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸鈉、磷酸二氫銨或硝酸銨作為氮源，按2.0%的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)不同氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.7.3 最適氮源濃度的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別設(shè)置氮源濃度為0.5%，1.0%，1.5%和2.0%，按2.0%的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)不同氮源濃度對產(chǎn)酶的影響。

1.7.4 最適培養(yǎng)基起始pH值的選擇 將發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH 值分別調(diào)至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0，按2.0%的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)培養(yǎng)基的起始pH值對產(chǎn)酶的影響。

1.7.5 培養(yǎng)基裝量對產(chǎn)酶的影響 在250mL的三角瓶中，分別裝入10，20，30，40，50，60和70mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按2.0%的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)培養(yǎng)基裝量對產(chǎn)酶的影響。

1.7.6 接種量對產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%（v／v）的接種量接入種子菌液，于130r／min，30℃搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)接種量對產(chǎn)酶的影響。

1.7.7 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響 在上述優(yōu)化條件下，分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為15，20，25，28，30和32℃，于130r／min搖床培養(yǎng)48h后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響。

1.7.8 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對產(chǎn)酶的影響 在上述優(yōu)化條件下，分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)數(shù)為80，100，130，150和180r／min，于最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)48后，測定發(fā)酵液酶活力，試驗(yàn)搖床轉(zhuǎn)數(shù)對產(chǎn)酶的影響。

1.7.9 培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響 在以上最優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，在250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，分別在8，12，16，20，24，36，48，60和72h取發(fā)酵液測酶活，試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

2.1.1 菌株初篩結(jié)果 通過平板劃線分離篩選到2株產(chǎn)硫酸軟骨素酶能力較強(qiáng)的菌株，在以硫酸軟骨素為唯一碳源的平板分離培養(yǎng)基上在菌落周圍產(chǎn)生較大的透明圈，分別編號為5號和28號，如圖1所示。沒有被酶解的大分子硫酸軟骨素能與Albumin bovine V結(jié)合并形成白色沉淀，而被菌體分泌的酶所降解形成的小分子硫酸軟骨素不能與Albumin bovine V結(jié)合，使菌落周圍能形成透明斑。

圖1 平板初篩結(jié)果Fig.1 Primary screening results of plate culture

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果 將已純化的具有較好產(chǎn)硫酸軟骨素酶能力的2株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，選取不同的氮源，結(jié)果顯示2種菌株在含有機(jī)氮的培養(yǎng)基中酶活都比較高，其中28號菌株在硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中也有較好的產(chǎn)酶能力，如圖2所示，故將28號菌株作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)菌株。

圖2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Secondary screening results of shaking culture

2.2 菌株鑒定結(jié)果

將經(jīng)過初篩和復(fù)篩的28號菌株進(jìn)行菌株鑒定。

2.2.1 形態(tài)特征 菌落黃色，近圓形，表面光滑、濕潤、不透明，邊緣整齊，略突起，直徑約0.2～0.3mm，菌體為桿狀，無孢子。

2.2.2 生理生化特征 革蘭氏反應(yīng)陰性，需氧非發(fā)酵型，氧化酶測定陽性，可氧化利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、纖維二糖，不能利用檸檬酸鹽，甘氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶和脯氨酸芳香胺基酶呈陽性，谷氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、脂酶和脲酶呈陰性，鑒定編碼為1601315150721001，鑒定度＝99.8（既極好的鑒定）。根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的測定結(jié)果，28號菌株初步鑒定為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。

2.3 菌株生長曲線

菌株生長在36h之前已進(jìn)入穩(wěn)定期，之后菌體密度不再隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而有明顯增加，且處于穩(wěn)定期的時(shí)間較長，見圖3。

圖3 28號菌株生長曲線圖Fig.3 Growth curve of strain 28

2.4 發(fā)酵條件的研究

2.4.1 最適碳源的選擇 不同碳源的產(chǎn)酶影響如圖4所示，以硫酸軟骨素為碳源發(fā)酵液的酶活力最高，其次是乳糖、果糖、蔗糖，硫酸軟骨素是最適碳源。

圖4 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of various carbon sources on chondroitinase production

2.4.2 最適氮源的選擇 不同氮源的產(chǎn)酶影響如圖5所示，有機(jī)氮作為氮源比無機(jī)氮作為氮源更有利于產(chǎn)酶，又以酵母粉最有利于產(chǎn)酶，其次是蛋白胨和牛肉膏。

圖5 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of various nitrogen sources on chondroitinase production

2.4.3 最適氮源濃度的選擇 以酵母粉為氮源的不同氮源濃度對產(chǎn)酶的影響如圖6所示，當(dāng)酵母粉濃度為1.0%時(shí)最有利于產(chǎn)酶。

圖6 不同氮源濃度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of different yeast extract concentration on chondroitinase production

2.4.4 最適培養(yǎng)基起始pH的選擇 結(jié)果如圖7所示，培養(yǎng)基的起始pH在6.0～10.0范圍內(nèi)酶活力均比較高，在pH＝8.5時(shí)酶活力最高；當(dāng)pH≤4.0時(shí)，酶活力很低。

圖7 培養(yǎng)基起始pH對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of initial pH of medium on production

2.4.5 培養(yǎng)基的裝液量對產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖8所示，使用250mL的三角瓶，裝量在20～60mL時(shí)產(chǎn)酶活力均較高，最適裝量為40mL。

圖8 裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of liquid volumes on chondroitinase production

圖9 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of amount of inoculation on chondroitinase production

2.4.6 接種量對產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖9所示，接種量對產(chǎn)酶的影響不大，當(dāng)接種量為1%時(shí)，酶活力最高，隨著接種量的加大，酶活力隨之降低，所以接種量為1%最有利產(chǎn)酶。

2.4.7 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖10所示，試驗(yàn)表明在20～30℃范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)酶活力相對較高，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，發(fā)酵液的酶活力最高。

圖10 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of culture temperature on chondroitinase production

2.4.8 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖11所示，試驗(yàn)表明較高的搖床轉(zhuǎn)數(shù)不利于產(chǎn)酶，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)在80～130r／min范圍內(nèi)時(shí)，酶活力比較高，以100r／min最有利于產(chǎn)酶。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)高于130r／min時(shí)，酶活力開始降低。

圖11 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effects of revolutions per minute on chondroitinase production

2.4.9 培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖12所示，試驗(yàn)表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，酶活力不斷增加，培養(yǎng)至36h時(shí)酶活力達(dá)到最大值，之后較長的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酶能力都很穩(wěn)定。

圖12 培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effects of culture time on chondroitinase production

3 討論

本研究中，28號菌株在以硫酸軟骨素為唯一碳源的平板上生長產(chǎn)生的透明圈直徑與菌落直徑的比值（D／d）較大，搖瓶復(fù)篩的結(jié)果表明其酶活力也較高，而且以有機(jī)氮為氮源的發(fā)酵液酶活力要比無機(jī)氮的高很多。但值得注意的是，雖然5號菌株的透明圈直徑與菌落直徑的比值（D／d）較小，搖瓶復(fù)篩結(jié)果卻表明其酶活力在有機(jī)氮中也較高，而且以牛肉膏為氮源時(shí)酶活力比28號菌株的要高。因此，菌株的D／d值的大小并不一定與液體發(fā)酵產(chǎn)酶能力的高低相對應(yīng)，在篩選過程中應(yīng)結(jié)合不同的方法進(jìn)行篩選，以免漏篩產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。

通過對28號菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，該菌發(fā)酵液的酶活力可達(dá)1.2U／mL。與Yamagata［8］所報(bào)道的肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）（酶活力為0.026U／mL），普通變形桿菌（Proteus vulgaris）（酶活力為0.06U／mL）以及蘇昕等［14］報(bào)道的溫和氣單孢菌（Aeromonas sobria）（酶活力為0.92U／mL）菌株的產(chǎn)酶活性相比，28號菌株的產(chǎn)酶能力強(qiáng)，并且酶活力穩(wěn)定。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，鑒定該菌株為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，是好氧菌，迄今尚未見報(bào)道。Yamagata［8］所報(bào)道的產(chǎn)酶菌株分別為肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum），普通變形桿菌（Proteus vulgaris），奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）等，皆為好氧菌；蘇昕等［14］從魚腹中分離到1株產(chǎn)酶活性較高的溫和氣單孢菌（Aeromonas sobria），兼性厭氧菌；陶科等［15］從屠宰廠等地篩選到1株產(chǎn)酶活性較高的彭氏變形桿菌（P.penneri），兼性厭氧菌。

將該菌株接種在含有0.5%的硫酸軟骨素的發(fā)酵液中，與不加硫酸軟骨素的對照比較酶活，在含有硫酸軟骨素的發(fā)酵液中檢測到的酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不含硫酸軟骨素的發(fā)酵液中檢測到得酶活，故篩選得到的28號菌株所產(chǎn)的硫酸軟骨素酶屬于誘導(dǎo)酶，而且酶被菌體分泌到胞外，這有利于后期酶的分離純化。

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