二甲雙胍格列吡嗪片人體生物等效性研究

李媛媛，梁宇光，郝光濤，曲恒燕，高洪志，劉偉麗，劉澤源（軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院藥學部，北京 100071）

二甲雙胍格列吡嗪片是由鹽酸二甲雙胍和格列吡嗪組成的復方制劑。鹽酸二甲雙胍是雙胍類糖尿病治療藥物，格列吡嗪是磺脲類降糖藥物，二者聯(lián)合用藥，具有協(xié)同降糖作用，降低了兩者用藥的初始劑量，增加了用藥的廣泛性，為糖尿病的治療提供了一個新途徑[1-2]。我們采用高效液湘色譜-質(zhì)譜（HPLCMS/MS）法測定服用二甲雙胍格列吡嗪片或鹽酸二甲雙胍片和格列吡嗪片后人血漿中二甲雙胍和格列吡嗪的濃度，并對受試制劑的藥動學特性、生物利用度及其與參比制劑的生物等效性進行研究。二甲雙胍格列吡嗪片藥代動力學研究國內(nèi)已有報道，但所用試驗藥物二甲雙胍與格列吡嗪的含量分別是250 mg和2.5 mg[3-5]，而本研究的試驗藥物兩制劑含量分別為500 mg和2.5 mg。本試驗對該規(guī)格的二甲雙胍格列吡嗪復方制劑的藥代動力學特性進行研究，為該藥的臨床應用提供參考，同時本研究中的血漿樣品預處理方法較文獻報道的方法簡便、快速、重復性強，為兩種藥物的血藥濃度檢測提供新思路。

1 材料

1.1 儀器

API 3000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源以及Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB公司）；Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津）；串聯(lián)質(zhì)譜儀為API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測器；GL-88B 旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AB104 電子分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO公司）；2K-15 高速低溫離心機（美國 Sigma 公司）；B600A型低速自動平衡離心機（中國白洋離心機廠）；Milli-Q Plus 純水器（美國密理博中國有限公司）。

1.2 藥品與試劑

受試制劑：二甲雙胍格列吡嗪片（德州博誠制藥有限公司，規(guī)格：每片含鹽酸二甲雙胍500 mg，格列吡嗪2.5 mg，批號100802）。參比制劑：格列吡嗪片（迪沙藥業(yè)，規(guī)格：每片含格列吡嗪2.5 mg，批號091211）；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：每片含鹽酸二甲雙胍500 mg，批號1004063）。

二甲雙胍對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100664-200602），內(nèi)標：苯乙雙胍對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100922-201001）；格列吡嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100281-200602），內(nèi)標：地西泮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號1230-9601）。

甲酸、乙腈為色譜純（DIMA公司）；其余試劑均為分析純；空白人血漿由軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院血液科提供。

2 方法

2.1 研究對象

24名男性健康受試者，平均年齡為（24.8±3.0）歲，平均身高為（169.8±4.3） cm，平均體重為（61.3±4.7） kg，體重指數(shù)（21.2±1.1） kg·m-2，均無煙酒嗜好，無藥物過敏史、藥物依賴史及慢性病史；均接受全面體檢，試驗前生命體征、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、心電圖及胸透等檢查未發(fā)現(xiàn)異常；受試前2周內(nèi)未服用任何其他藥物；受試期間統(tǒng)一清淡飲食，禁止劇烈活動，禁飲茶、酒及含咖啡因的飲料，或某些可能影響代謝的果汁等。受試者均自愿參加并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準實施。

2.2 給藥方案與血樣采集

本試驗采用雙周期自身交叉設(shè)計，單劑量口服給藥。24名受試者隨機進入2個試驗組，每組12名。每組受試者每次試驗時分別服用受試制劑二甲雙胍格列吡嗪片一片；或參比制劑鹽酸二甲雙胍片和格列吡嗪片各一片，同時服用。

受試者于用藥前一日入?、衿谂R床試驗病房，統(tǒng)一進清淡平衡膳食，晚餐后禁食不禁水12 h，次日晨8:00左右空腹以200 mL溫開水（含50 g葡萄糖）服藥，服藥后2 h飲水200 mL（含50 g葡萄糖），服藥后4 h統(tǒng)一進低脂膳食。兩次用藥間隔7 d。分別于給藥前及給藥后0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，15，24 h采集上肢靜脈血，肝素抗凝，3000 r·min-1離心10 min，分離血漿，血漿樣品置- 40 ℃冰箱保存待測。

2.3 二甲雙胍血漿藥物濃度測定方法

2.3.1 色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜柱：Luna 5u CN 100A（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-30 mmol·L-1乙酸銨水溶液（80∶20）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子化源（ESI源）；離子極性：正離子；離子檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）方式；噴射電壓：5400 V；離子源溫度：450 ℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力：12 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，N2）壓力：7 psi；CE電壓：30 V；用于定量分析的離子反應對分別為質(zhì)荷比m/z130.0→m/z71.0（二甲雙胍）和m/z206.2→m/z105.2（苯乙雙胍，內(nèi)標）。

2.3.2 血漿樣品處理與測定 精密量取血漿樣品200 μL，加入內(nèi)標溶液（1000 μg·L-1苯乙雙胍乙腈溶液）50 μL，渦旋混合均勻，加入乙腈700 mL，渦旋混合均勻，15 000 r·min-1，4 ℃低溫離心10 min，取上清液進樣5 μL進行 HPLC-MS/MS分析。

2.3.3 標準曲線的制備 取空白血漿200 μL，分別精密加入二甲雙胍標準系列溶液200 μL和內(nèi)標溶液50 μL，渦旋混合均勻，配制成相當于二甲雙胍血漿濃度分別為25，50，100，250，500，1000，2000和2500μg·L-1的血漿樣品，按血漿樣品處理方法進行處理、測定，以血漿中待測物濃度（x）為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值（y）為縱坐標，用加權(quán)（w = 1/x2）最小二乘法進行回歸運算，得回歸方程：y= 0.002 79x- 0.054 9，r= 0.996 0。二甲雙胍血藥濃度在25 ～2500 μg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，定量下限為25μg·L-1。

2.3.4 精密度與準確度 在空白人血漿中加入不同量的二甲雙胍制成低、中、高（50，250，2000 μg·L-1）不同濃度的標準血漿樣品，每個濃度各6 個樣品，按上述測定方法分別測定日內(nèi)、日間變異，得二甲雙胍血漿中低、中、高三個濃度的平均日內(nèi)精密度分別為2.58%，1.74%和1.69%，日間精密度分別為2.61%，9.96%和6.16%，均＜15%，平均相對回收率分別為（89.33±2.30）%，（90.27±1.57）%和（102.50±1.73）%。

2.3.5 樣品穩(wěn)定性 二甲雙胍血漿樣品在經(jīng)過反復3次- 40 ℃凍融，- 40 ℃冰凍放置2個月，樣品處理后進樣器中放置24 h，樣品室溫放置4 h的條件下，進行穩(wěn)定性考察，RE均在±15%內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

2.4 格列吡嗪血漿藥物濃度測定方法

2.4.1 色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax-extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（30∶70）；流速：1.2 mL·min-1（80%分流）；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

離子源：電噴霧離子化源（ESI源）；離子極性：正離子；離子檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM） 方式；噴射電壓：5400 V；離子源溫度：450 ℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力：60 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，N2）壓力：60 psi；氣簾氣體（N2）壓力：8 psi；CE電壓：20 V；用于定量分析的離子反應對分別為質(zhì)荷比m/z446.0→m/z321.0（格列吡嗪）和m/z285.0→m/z193.0（地西泮，內(nèi)標）。

2.4.2 血漿樣品處理與測定 精密量取血漿樣品50 μL，加入內(nèi)標溶液（100 μg·L-1地西泮乙腈溶液）50 μL，渦旋混合均勻，加乙腈100 mL，渦旋混合均勻，15 000 r·min-1，4 ℃低溫離心10 min，取上清液進樣10 μL進行 HPLC-MS/MS分析。

2.4.3 標準曲線的制備 取空白血漿50 μL，分別精密加入格列吡嗪標準系列溶液50 μL 和內(nèi)標溶液50 μL，渦旋混合均勻，配制成相當于格列吡嗪血漿濃度分別為5，10，20，50，100，200，500和1000 μg·L-1的血漿樣品，按血漿樣品處理方法進行處理、測定，以血漿中待測物濃度（x）為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值（y）為縱坐標，用加權(quán)（w = 1/x2）最小二乘法進行回歸運算，得回歸方程：y= 0.002 7x-0.002 18，r= 0.998 5。格列吡嗪血藥濃度在5 ～ 1000μg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，定量下限為5 μg·L-1。

2.4.4 精密度與準確度 在空白人血漿中加入不同量的格列吡嗪制成低、中、高（15，80，800 μg·L-1）不同濃度的標準血漿樣品，每個濃度6個樣品，按上述測定方法分別測定日內(nèi)、日間變異，得格列吡嗪血漿中低、中、高三個濃度的平均日內(nèi)精密度分別為3.46%，3.54%和2.42%，日間精密度分別為4.04%，7.29%和6.03%，均＜15%，平均相對回收率分別為（109.89±3.80）%，（89.31±3.16）%和（90.10±2.18）%。

2.4.5 樣品穩(wěn)定性 格列吡嗪血漿樣品在經(jīng)過反復3次- 40 ℃凍融，- 40 ℃冰凍放置2個月，樣品處理后進樣器中放置24 h，樣品室溫放置4 h的條件下，進行穩(wěn)定性考察，RE均在±15%，穩(wěn)定性良好。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Phoenix WinNonlin 6.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，計算24名受試者單次口服受試及參比制劑后個體藥代動力學參數(shù)，并對兩種制劑進行生物等效性評價。根據(jù)每一個受試者口服受試制劑和參比制劑后AUC0-tn和AUC0-∞，求得受試制劑的相對生物利用度，并求出其均值及標準差。

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度-時間曲線

受試者口服受試制劑和參比制劑后，二甲雙胍和格列吡嗪平均血藥濃度－時間曲線見圖1。

圖1 受試者服用受試制劑和參比制劑后平均血藥濃度－時間曲線A - 二甲雙胍；B - 格列吡嗪Fig 1 Mean plasma concentration-time curves after taking the test and reference drugs in 24 healthy volunteersA - metformin; B - glipizide

3.2 藥代動力學參數(shù)

24名健康受試者口服受試制劑和參比制劑后的主要藥代動力學參數(shù)見表1。

表1 受試者口服受試制劑及參比制劑后二甲雙胍和格列吡嗪的主要藥代動力學參數(shù)Tab 1 The main pharmacokinetic parameters of metformin and glipizide after taking the test and reference drugs in 24 healthy volunteers

3.3 生物等效性評價

中國健康成年男性受試者口服受試制劑二甲雙胍格列吡嗪片和參比制劑鹽酸二甲雙胍片、格列吡嗪片后，主要藥代動力學參數(shù)進行方差分析，結(jié)果表明兩制劑間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；對參數(shù)AUC、Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析、90%置信區(qū)間檢驗，二甲雙胍AUC0-tn、AUC0-∞、Cmax90%的置信區(qū)間分別為87.41% ～ 102.59%，87.46% ～ 102.11%，83.13% ～ 101.45%；格列吡嗪AUC0-tn、AUC0-∞、Cmax的90%置信區(qū)間分別為92.44% ～ 105.89%，92.49% ～105.60%，96.17% ～ 112.95%；對tmax進行非參數(shù)法檢驗，兩制劑無顯著性差異。結(jié)果表明受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

4 討論

二甲雙胍格列吡嗪片藥代動力學研究之前也有文獻報道，但其樣品處理方法采用二氯甲烷進行液液萃取[3]，或者采用高氯酸加二氯甲烷萃取[4,6]進行二甲雙胍的血藥濃度分析，或者加入乙酸、乙腈離心，上清液吹干石油醚復溶再提取[7]，操作步驟繁多。本研究為了簡化樣品處理方法，在流動相中分別加入了乙酸銨（二甲雙胍）和甲酸（格列吡嗪），提高了分析的靈敏度，樣品預處理只需乙腈蛋白沉淀后離心即可，簡便可靠、重現(xiàn)性好。同時文獻[3-4,8]報道的方法需要樣本量較大，而本研究需要血漿量較少，二甲雙胍需要200 μL，而格列吡嗪僅需50 μL，大大減少了對受試者身體的損害。

本研究中受試制劑二甲雙胍格列吡嗪片與參比制劑鹽酸二甲雙胍片、格列吡嗪片的藥代動力學參數(shù)表明，二者在人體內(nèi)吸收、分布、消除規(guī)律較為接近。受試制劑中二甲雙胍的相對生物利用度F0-tn、F0-∞分別為（97.18±23.26）%和（96.83±22.43）%，格列吡嗪的相對生物利用度F0-tn、F0-∞分別為（100.73±19.66）%和（100.59±19.70）%。經(jīng)生物等效性評價，表明受試制劑二甲雙胍格列吡嗪片與參比制劑鹽酸二甲雙胍片、格列吡嗪片在體內(nèi)的吸收、分布、消除過程相似，二者具有生物等效性。

綜上所述，兩種制劑復方后所得復方制劑口服與兩種單藥共同服用具有生物等效性，本實驗為臨床選擇二甲雙胍格列吡嗪復方制劑提供參考。

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