犀黃丸對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2，9蛋白表達(dá)的影響*

孫莉娜，孟靜巖，王 威，應(yīng)森林，李 丹，馬佐英，賈彥燾

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

犀黃丸對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2，9蛋白表達(dá)的影響*

孫莉娜1，孟靜巖1，王 威1，應(yīng)森林1，李 丹1，馬佐英1，賈彥燾2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究犀黃丸含藥血清對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2,9（MMP-2，MMP-9）表達(dá)的影響及意義。[方法]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法，檢測(cè)犀黃丸含藥血清作用下LoVo細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平。[結(jié)果]在犀黃丸含藥血清的干預(yù)下，LoVo細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的蛋白分泌水平與空白對(duì)照組比較明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[結(jié)論]犀黃丸可能通過抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，達(dá)到抑制大腸癌轉(zhuǎn)移的作用。

LoVo細(xì)胞；犀黃丸；含藥血清；基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9

大腸癌（CRC）是結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，為臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第3位。隨著人們生活飲食水平的提高，其發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前，手術(shù)仍為主要治療方法，但其根治性手術(shù)切除后5 a生存率僅為50%左右[1]，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。因此，深入研究和探討大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制具有非常重要的意義?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)成分，是血管新生的重要環(huán)節(jié)[2]，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中占據(jù)重要地位，其中以MMP-2、MMP-9最為關(guān)鍵[3]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中MMP-2、MMP-9呈現(xiàn)過表達(dá)，在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展中起重要作用，且MMP-2蛋白表達(dá)能作為結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[4]。

犀黃丸又名西黃丸，載于清·王維徳所著《外科證治全生集·卷四》，由牛黃、麝香、乳香、沒藥4味組成，具有清熱解毒、消痰軟堅(jiān)、化瘀散結(jié)、消腫止痛之功[5]。實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)和臨床研究均提示，犀黃丸對(duì)各種腫瘤具有一定的治療作用，其抗癌譜廣且毒副作用小，是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥之一[6]。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，采用血清藥理學(xué)方法，研究犀黃丸干預(yù)大腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 LoVo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)情況，探討犀黃丸干預(yù)大腸癌轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑 犀黃丸為天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠生產(chǎn)。MMP-2，MMP-9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品，F(xiàn)12K培養(yǎng)基（北京邁晨科技有限公司），胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries），胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）,青霉素、鏈霉素均為國(guó)產(chǎn)市售產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 Wistar大鼠24只，體質(zhì)量（210±10）g，雄性，購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SGXK（津）2009-0001。人大腸癌LoVo細(xì)胞株，購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），用含有10%FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 含藥血清制備 Wistar大鼠藥物組采用前期細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳的相對(duì)高劑量用藥組（6倍7d組和6倍14d組）即以犀黃丸臨床6倍劑量換算為大鼠劑量3.24g/（kg·d），給予犀黃丸混懸液，每日2次，每次2mL，進(jìn)行灌胃。設(shè)立相應(yīng)空白對(duì)照組（空白7d、空白14d組），給予等劑量生理鹽水。按要求分別灌胃7、14d，末次給藥1h后，乙醚麻醉股動(dòng)脈取血，分離血清，56℃、滅活30min，過濾除菌、分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備 10%FBS的F12K培養(yǎng)液、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。4.5×104個(gè)細(xì)胞/（mL·孔），接種于24孔培養(yǎng)板中，于5%CO2，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，10%含藥血清的F12K培養(yǎng)液作用48h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集培養(yǎng)上清液，分裝，凍存于-20℃中備用。使用前12 000g離心5min，取上清液即可檢測(cè)。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)MMP-2、MMP-9 采用由美國(guó)R&D公司生產(chǎn)的MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。用多功能微孔板分析儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)吸光度值，計(jì)算樣品相應(yīng)蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，人大腸癌LoVo細(xì)胞培養(yǎng)上清中，MMP-2、MMP-9蛋白在各組均有表達(dá)。藥物組MMP-2、MMP-9表達(dá)水平與各自空白對(duì)照組相比均有所下降；6倍7d組中MMP-2表達(dá)與其空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見表1），6倍14d組與其空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；6倍7d組和6倍14d組中MMP-9與各自空白對(duì)照組相比表達(dá)水平均表現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)（P<0.01，見表2）。兩空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是腫瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)散的自然屏障，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解是癌癥轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟。腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用是通過產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶類實(shí)現(xiàn)的[7]。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨著腫瘤TNM分期的增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，MMP-2、MMP-9的表達(dá)逐漸增高，腫瘤降解ECM基底膜的能力增強(qiáng)，侵襲性增加，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性也增大[8]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平與胃癌、卵巢癌、肺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。

表1 犀黃丸含藥血清對(duì)LoVo細(xì)胞MMP-2的影響（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

表1 犀黃丸含藥血清對(duì)LoVo細(xì)胞MMP-2的影響（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別 A450 nm OD值 MMP-2濃度（μg/mL）6倍7d組 1.049±0.039 0.721±0.034*空白7d組 1.145±0.021 0.803±0.0186倍14d組 1.076±0.070 0.744±0.061空白14d組 1.130±0.071 0.791±0.062

表2 犀黃丸含藥血清對(duì)LoVo細(xì)胞MMP-9的影響（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

表2 犀黃丸含藥血清對(duì)LoVo細(xì)胞MMP-9的影響（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01。

犀黃丸是治療乳巖、瘰疬、痰核、肺癰等的名方，方中牛黃芳香性寒，能清熱解毒，豁痰開竅，消腫止痛，輔以麝香辛通走竄，能通行十二經(jīng)脈，具有開竅醒神，活血化瘀，消腫止痛之功。佐藥乳香、沒藥為常用藥對(duì)，合用可通經(jīng)疏絡(luò)，活血行氣，消腫止痛。此方為清熱解毒，活血祛瘀，軟堅(jiān)消腫之上品?，F(xiàn)代藥理研究表明，犀黃丸可以起到抗炎，鎮(zhèn)痛，止血消腫和抗癌等作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛黃能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，以牛黃為主的中藥組方能明顯提高機(jī)體的免疫功能，減輕化療的毒副作用且不影響腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)[10]；麝香具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和影響癌基因、抑癌基因的表達(dá)[11]；乳香沒藥能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，用犀黃丸含藥血清作用于人大腸癌LoVo細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的MMP-2和MMP-9的活性蛋白表達(dá)量下降，提示犀黃丸能夠降低LoVo細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平，可能是犀黃丸能夠抑制大腸癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制之一。由于中藥含藥血清成分復(fù)雜，中藥復(fù)方在機(jī)體內(nèi)循環(huán)起作用的機(jī)制尚在探索階段，因此犀黃丸含藥血清降低MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平的明確機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探討和研究。

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Effect of Xihuang pills on protein expressions of MMP-2 and MMP-9 in human colorectal carcinoma LoVo cell

SUN Li-na1,MENG Jing-yan1,WANG Wei1,YING Sen-lin1,LI Dan1,MA Zuo-ying1,JIA Yan-tao2
（1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China; 2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the effect of Xihuang pills(medicine-contained serum)on the protein expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in human colorectal carcinoma LoVo cell.[Methods]The enzyme-linked immunoassay(ELISA)was used to determine the expression of MMP-2 and MMP-9 in the culture solution of LoVo cell under the action of Xihuang pills.[Results]The expression of MMP-2 and MMP-9 in medication groups was significantly lower than those of control group (P<0.05).[Conclusion]Xihuang pill has a potent effect of reducing the expressions of MMP-2 and MMP-9.This mechanism may play an important role in the suppression of colorectal carcinoma metastasis.

LoVo cell；Xihuang pills；medicine-contained serum；matrix metalloproteinase-2,9

R285.5

A

1672-2-5 （2012）04-0378-03

2012-05-04）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3087227）。

孫莉娜（1983-），女，2009級(jí)碩士研究生，主要從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論及脾胃病中醫(yī)藥診療方法研究。

孟靜巖。