更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)及 Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

江 波，張端蓮

（1.湖北省武漢市三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430061；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430062）

更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)及 Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

江 波1，張端蓮2

（1.湖北省武漢市三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430061；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430062）

[目的]探討更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。[方法]選用鼠齡為11～15個(gè)月的自然更年期雌性SD大鼠，20只,隨機(jī)分為2組，即更年平調(diào)液組（P組）、更年期對(duì)照組（M組）。另選鼠齡為4～6個(gè)月的SD大鼠，10只，為青年對(duì)照組（Y組）。藥物干預(yù)第45天，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達(dá)，利用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)測(cè)量各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達(dá)水平。[結(jié)果]更年平調(diào)液組Bcl－2、Bax的表達(dá)較更年期對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較Bcl－2、Bax的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。[結(jié)論]更年平調(diào)液能抑制心肌細(xì)胞凋亡而對(duì)心肌細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用。

更年平調(diào)液；心?。桓昶诖笫?；Bcl-2；Bax；凋亡；免疫組織化學(xué)

更年期綜合征是指更年期婦女卵巢功能逐漸衰退直至消失的一個(gè)過渡時(shí)期，由此引起的內(nèi)分泌失調(diào)和植物神經(jīng)功能紊亂是其主要證候，絕經(jīng)是其主要標(biāo)志，臨床表現(xiàn)除月經(jīng)紊亂、眩暈耳鳴外，還有胸悶煩躁、心悸氣短、烘熱出汗、失眠多夢(mèng)或精神抑郁等一系列癥狀群[1-2]。中醫(yī)學(xué)稱其為“絕經(jīng)前后諸癥”，多發(fā)于45～55歲婦女期，根據(jù)癥狀的不同亦可歸屬于“心悸”、“臟躁”、“失眠”、“崩漏”等范疇。

中醫(yī)認(rèn)為：絕經(jīng)前后，婦女“七七”任脈虛衰，太沖脈衰，天癸竭，腎氣漸衰，肝腎功能不足，精血虧損，陰陽失調(diào)。因腎為先天之本，主藏精，主生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖。肝主要藏血,血化精。人體五臟六腑靠精血濡養(yǎng)，則身體健康。肝腎軾能虧損，精血不足，則表現(xiàn)諸證[3]。肝腎虛損，陰不制陽，肝陽上亢，則面赤烘熱,煩躁易怒。陰虛生熱則口苦、口干、多汗。腎陰虧損,則頭暈?zāi)垦?、腰膝酸軟、失眠、多?mèng)、記憶力減退。肝血不足,血不養(yǎng)筋脈,則關(guān)節(jié)疼痛,四肢麻木,陰陽失調(diào)。

更年期平調(diào)液經(jīng)長(zhǎng)期大量臨床觀察研究證實(shí)能明顯改善更年期婦女的心血管癥狀，減慢心率，改善心室功能，但其作用機(jī)制尚未明確。

細(xì)胞凋亡是近年來的研究熱點(diǎn)之一,也是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),其中Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程的作用的研究備受重視，Bcl-2和Bax是該家族中的重要成員,兩者主要通過線粒體途徑參與凋亡過程，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激信號(hào),與Bcl-2相結(jié)合的Bax就會(huì)被置換出來,線粒體膜通透性增加,釋放出一系列物質(zhì),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4-5]。研究認(rèn)為Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax的比值對(duì)于決定細(xì)胞接受死亡刺激信號(hào)后存活與否起關(guān)鍵性作用[6]。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法，觀察了更年期平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌組織內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)水平，探討更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制，以期為臨床運(yùn)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 更年平調(diào)液組（P組，n=10）：SD大鼠，雌性，鼠齡為11～15個(gè)月，經(jīng)陰道細(xì)胞涂片證實(shí)屬更年期，給予更年平調(diào)液組干預(yù)，為治療組。更年期對(duì)照組（M組，n＝10）：大鼠選取同更年平調(diào)液組，給與生理鹽水，為陰性對(duì)照組。青年對(duì)照組（Y組，n＝10）：SD大鼠，鼠齡為4～6個(gè)月，雌性。

各組處理方案：P組按照20mL/kg體質(zhì)量給與更年平調(diào)液灌胃，每日1次,連續(xù)45d；M組按照20mL/kg體質(zhì)量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)45d；Y組處理方法同M組。最后1次灌胃后24h，麻醉取心肌組織做免疫組織化檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 更年平調(diào)液由枸杞子、肉蓯蓉、制何首烏、女貞子及龍齒等12味中藥組成,由武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房配制（廣州濟(jì)光制藥,批號(hào)900803）。

1.3 主要試劑和儀器 濃縮型兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新公司）；YWY781型醫(yī)用微波儀（浙江臨安電子器材廠）；家用高壓鍋。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 將各組藥物干預(yù)的大鼠麻醉處死，取臟，切成小方塊用10%甲醛固定，組織切片，常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗；3%過氧化氫，常溫孵育10min，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗4次，每次5min；10%正常山羊血清（PBS稀釋）室溫孵育10min，去血清，勿洗；滴加一抗37℃孵育1.5h，PBS洗4次，每次5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；滴加辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；DAB顯色液顯色，自來水充分沖洗；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.5 結(jié)果判斷 心肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為抗體標(biāo)記的Bcl-2、Bax陽性反應(yīng)，對(duì)Bcl-2、Bax表達(dá)陽性的切片進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的視野（×400），用軟件檢測(cè)每個(gè)視野下陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，根據(jù)各組陽性表達(dá)情況分別計(jì)算陽性面積率（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積× 100%）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2的表達(dá) 更年平調(diào)液組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見深棕黃色密集顆粒，說明Bcl-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖1）；更年期對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)無明顯棕黃色顆粒，說明Bcl-2無表達(dá)（見圖2）；青年對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見淡黃色顆粒密集，Bcl-2呈陽性表達(dá)（見圖3），較更年平調(diào)液組稍弱。分析結(jié)果經(jīng)q檢驗(yàn)，更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組Bcl-2的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較Bcl-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

表1 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

表1 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

注：更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組比較，*P＜0.01；更年期對(duì)照組與青年對(duì)照組比較，#P＜0.01。

組別 n 平均吸光度（A值） 陽性面積率（%）更年平調(diào)液組（P組） 10 0.4037±0.0613* 33.42±6.42更年期對(duì)照組（M組） 10 0.1041±0.0063# 10.13±5.40#青年對(duì)照組（Y組） 10 0.4086±0.0594## 33.32±5.07##

2.2 Bax的表達(dá) 更年平調(diào)液組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)未見明顯的棕黃色顆粒，Bax呈低表達(dá)（見圖4）；更年期對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色密集顆粒，Bax呈陽性表達(dá)（見圖5）；青年對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)未見棕黃色，Bax無表達(dá)（見圖6）。圖像分析結(jié)果。

經(jīng)q檢驗(yàn)，更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組比較Bax的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較Bax的表達(dá)異性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表2。

表2 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bax的表達(dá)的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

表2 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bax的表達(dá)的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

注：更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組比較，*P＜0.01。更年期對(duì)照組與青年對(duì)照組比較，#P＜0.01。

組別 n 平均吸光度（A值） 陽性面積率（%）更年平調(diào)液組（P組） 10 0.1171±0.0504* 19.14±5.26更年期對(duì)照組（M組） 10 0.3271±0.0173# 41.06±14.68#青年對(duì)照組（Y組） 10 0.1163±0.0534## 17.32±4.79##

3 討論

婦女更年期是指月經(jīng)完全停止前數(shù)月或數(shù)年至絕經(jīng)后若干年的一段時(shí)間,在月經(jīng)將絕未絕的1～2 a間，部分婦女將會(huì)出現(xiàn)植物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等紊亂為主的臨床癥狀群，主要表現(xiàn)為陣發(fā)性烘熱出汗、盜汗、煩躁易怒、頭暈?zāi)垦！n郁、精神萎靡等癥狀，這些統(tǒng)稱為更年期綜合征[7]。在此時(shí)期，部分婦女由于雌激素減少引起骨質(zhì)疏松以及因植物神經(jīng)功能紊亂而出現(xiàn)胸悶、心悸氣短等心血管系統(tǒng)癥狀[8-9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，更年期綜合征是女子七七天癸竭，腎氣衰，月經(jīng)將閉，腎氣漸衰，沖任虛損，精血不足，調(diào)節(jié)陰陽相對(duì)平衡的機(jī)能失常，辨證施治,予以補(bǔ)腎法療法[10]，同時(shí)還認(rèn)為腎為元陰元陽，腎在下焦，屬水，心在上焦，屬火，腎中之陰上升至心，則能涵養(yǎng)心陰，心中之陽下降至腎，能溫養(yǎng)腎陽，對(duì)于更年期綜合征的患者，予以補(bǔ)腎藥的同時(shí)給與歸心、肝的藥，可以平衡陰陽，調(diào)節(jié)沖任。

細(xì)胞凋亡，是各種細(xì)胞在一定條件下，通過啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制，引起內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生細(xì)胞的自然死亡[11]。細(xì)胞凋亡的過程是一種多種因子參與調(diào)節(jié)的過程，其中研究認(rèn)為bcl-2家族被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，bcl-2家族包含兩種功能調(diào)控基因：以bcl-2為代表的抑制凋亡基因和以Bax為代表的促進(jìn)凋亡基因，Bax蛋白具有對(duì)抗Bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡的能力。

Bcl-2基因最早是從濾泡性B細(xì)胞淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因[12]，Vaux等[13]首先發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因能延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，后有諸多研究顯示Bcl-2基因可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡，故稱其為凋亡抑制基因。Bcl-2主要存在于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，Bcl-2蛋白羧基端的跨膜區(qū)域?qū)cl-2蛋白發(fā)揮抑制凋亡功能起決定性作用。其機(jī)制可能是：1）Bcl-2蛋白位于線粒體上，通過抑制氧自由基的產(chǎn)生或起一種抗氧化劑的作用，而產(chǎn)生抗凋亡作用[14]。2）細(xì)胞凋亡中DNA的消化需要相關(guān)的Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶參與，Bcl-2通過阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制[15]。3）細(xì)胞凋亡時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C減少及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C增加，而Bcl-2主要定位于線粒體上，Bcl-2可能通過影響線粒體釋放細(xì)胞色素C的過程來調(diào)節(jié)凋亡[16]。Bax是Bcl-2家族中的一個(gè)重要成員，其與Bcl-2有21%的同源性，由192個(gè)氨基酸組成，其C-端含有疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)域[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族成員蛋白共同點(diǎn)是在蛋白鏈上都存在3個(gè)結(jié)構(gòu)基序，分別稱為BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域[19]。Bcl-2和Bax的突變分析表明，保守的BH結(jié)構(gòu)域是蛋白具有異源或同源二聚體形成的關(guān)鍵區(qū)域。同時(shí)研究認(rèn)為Bcl-2與Bax比例決定了細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)是否發(fā)生凋亡，若Bcl-2和Bax表達(dá)量平衡，形成的Bcl-2/Bax異源二聚體占優(yōu)勢(shì)，若Bcl-2過度表達(dá)而Bax表達(dá)不相應(yīng)增多,會(huì)使細(xì)胞凋亡趨勢(shì)減弱，而細(xì)胞存活期延長(zhǎng)；若Bax過表達(dá)，而Bcl-2表達(dá)不相應(yīng)增多，則誘發(fā)凋亡，Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素,Bcl-2和Bax共同協(xié)調(diào)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[20]，因此Bax與Bcl-2的比值決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性，由此構(gòu)成一個(gè)新的調(diào)定點(diǎn)[21]。檢測(cè)這兩類蛋白的變化，就能多方面的了解凋亡信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)所引起的變化。

本實(shí)驗(yàn)用更年平調(diào)液給更年期大鼠灌胃，經(jīng)免疫組織化學(xué)方法顯示，更年平調(diào)液組心肌細(xì)胞Bcl-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)，Bax無表達(dá)，表明Bcl-2具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。更年期對(duì)照組心肌細(xì)胞Bcl-2無表達(dá)，Bax呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表明該組心肌有發(fā)生凋亡的趨勢(shì)。青年對(duì)照組心肌細(xì)胞Bcl-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)，Bax無表達(dá)，這可能是尚存活的心肌的一種自我保護(hù)機(jī)制。結(jié)果還提示Bcl-2在更年平調(diào)液組的表達(dá)高于更年期對(duì)照組，Bax在更年期對(duì)照組的表達(dá)高于更年平調(diào)液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在更年平調(diào)液組，Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，Bax低表達(dá)，可以形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體和少量Bcl-2/Bax異源二聚體，而這兩種二聚體存在時(shí)起抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞存活的作用。而Bax在更年期對(duì)照組表達(dá)增高，致使Bcl-2表達(dá)的減少，在更年期對(duì)照組Bax表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，形成Bax/Bax同源二聚體增多，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2的表達(dá)和Bax的過度表達(dá)在人心肌缺血保護(hù)或促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡過程中可能具有重要的病理生理作用。Bax蛋白與Bcl-2蛋白共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。更年期平調(diào)液經(jīng)多年臨床應(yīng)用已證實(shí)能明顯改善更年期婦女的心血管癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：心為火，腎為水，水火相濟(jì)，心腎功能才可以維持平衡，因此可用補(bǔ)腎法來調(diào)節(jié)心臟功能。更年平調(diào)液中肉蓯蓉、枸杞子、女貞子和制何首烏具有補(bǔ)益肝腎、調(diào)節(jié)沖任的功效，龍齒平肝潛陽,鎮(zhèn)靜安神，諸藥合用使肝腎之陰得補(bǔ)，陽亢得抑，其目的是使“陰平陽秘”，以平為度。更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞的作用是能減少凋亡細(xì)胞數(shù)，增加成活細(xì)胞數(shù)，對(duì)心肌細(xì)胞起了重要的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

更年平調(diào)液能抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用。

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Effect of Gengnian Pingtiao liquid on expression of Bcl-2 and Bax in myocardial cell of rats with climacteric

JIANG Bo1,ZHANG Duan-lian2
（1.Department of TCM,The Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430061,China; 2.Basic Medical College of Wuhan University,Wuhan 430062,China）

[Objective]To explore of protective effects of Gengnian Pingtiao liquid on myocardial cell of rats with Climacteric.[Methods]The 20 SD rats of 11 to 15 months old with the natural climacteric were randomly divided into two groups:Gengnian Pingtiao liquid group (group P),menopause control group (group M).Another 10 SD rats,4～6 month old were taken for young control group (group Y).After experiment for 45 days,the average optical density(OD)and the rate of positive area of expression of Bcl-2 and Bax were analyzed by image analysis with HPIAS-2000 analysis system.[Results]The expression of Bcl-2 in group P was significantly higher than that in group M(P<0.01).No significant difference of expression of Bcl-2 was found between the group P and that in group Y(P＞0.05). The expression of Bax in group P was significantly lower than that in group M(P<0.01).No significant difference was found in the expression of Bax between group P and that in group Y(P＞0.05).[Conclusion]Gengnian Pingtiao liquid can inhibit the myocardial cell apoptosis and plays an important protective role for myocardial cell.

Gengnian Pingtiao liquid;cardiac muscle;menopause rats;Bcl-2;Bax;apoptosis;immunohistochemistry

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0367-05

2012-02-13）

江 波（1968-），女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療老年病。