p63基因亞型的表達(dá)對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

李國勝 王紅巖 劉崢嶸

（遼寧省人民醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽 110016）

人類p63基因定位于染色體3q27～29區(qū)，在兩個不同的啟動子控制下，編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：一類為全長型p63（TAp63），能夠反式激活p53靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抑癌基因的活性。另一類為截短型p63（ΔNp63），該類p63由于缺乏酸性N端反式激活區(qū)，喪失反式激活p53靶基因以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡的功能。本研究通過一系列基因操控實驗來檢測p63基因亞型表達(dá)水平的改變對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌細(xì)胞系MKN28

1.1.2 主要試劑

第一抗體（TAp63，ΔNp63）；抗鼠的HRP標(biāo)記二抗IgG；SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit；Western Blotting Chemiluminescence Luminol Kit；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；Taq DNA聚合酶 ；無RNase活性的DNase及RNase inhibitor；細(xì)胞總蛋白提取蛋白酶抑制劑（aprotinin、Leupetin、PMSF）；限制性核酸內(nèi)切酶（BamHⅠ、XhoⅠ）

1.1.3 TAp63α和ΔNp63α克隆引物序列

1.1.4 載體

pEGFP-N1 、pGEX-T-easy。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MKN28。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增TAp63α和ΔNp63α并全長序列克隆入pEGFP-N1載體中，從而構(gòu)建TAp63α及ΔNp63α的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α。

1.2.3 利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法，分別用pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α轉(zhuǎn)染MKN28胃癌細(xì)胞系，從而構(gòu)建TAp63α及ΔNp63α的高表達(dá)細(xì)胞系。合成TAp63及ΔNp63的siRNA oligo。分別將TAp63及ΔNp63的siRNA oligo轉(zhuǎn)染入MKN28胃癌細(xì)胞系，從而構(gòu)建TAp63及ΔNp63的基因沉默細(xì)胞系。提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行western blot檢測TAp63和ΔNp63的表達(dá)。

1.2.4 Annexin v/PI染色方法檢測TAp63、ΔNp63高表達(dá)或敲除對MKN28凋亡的影響：利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法，用pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72h后，Annexin v/PI檢測細(xì)胞凋亡狀況。實驗重復(fù)3次，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差縱坐標(biāo)作圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α克隆，測序證明克隆序列無突變（圖1）。

圖1 pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α的5’端測序結(jié)果截圖

2.2 Western blot驗證pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉(zhuǎn)染效果（圖2）。結(jié)果顯示：pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α轉(zhuǎn)染后，可檢測到外源性TAp63α和ΔNp63α的表達(dá)，其分子量略大于內(nèi)源性TAp63α和ΔNp63α；而TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo轉(zhuǎn)染后，TAp63和ΔNp63的表達(dá)水平明顯下降。

圖2 Western blot驗證pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉(zhuǎn)染效果

2.3 Annexin v/PI染色方法檢測TAp63、ΔNp63高表達(dá)或敲除對MKN28細(xì)胞凋亡的影響。

結(jié)果顯示：TAp63高表達(dá)能促進(jìn)凋亡，在沒有凋亡誘導(dǎo)劑存在的條件下，TAp63敲除對MKN28的凋亡無明顯影響（圖3、圖4）；ΔNp63敲除顯著促進(jìn)凋亡，在沒有凋亡誘導(dǎo)劑存在的條件下，ΔNp63高表達(dá)對MKN28細(xì)胞的凋亡無明顯影響（圖3、圖5）。

圖3 TAp63、ΔNp63高表達(dá)或敲除對MKN28凋亡的影響

圖4 TAp63高表達(dá)或敲除對MKN28凋亡影響

圖5 ΔNp63高表達(dá)或敲除對MKN28凋亡影響

3 討 論

p63基因具有與p53基因高度的序列和結(jié)構(gòu)同源性，主要包含p53家族經(jīng)典的三部分結(jié)構(gòu)：N-末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、核心DNA結(jié)合區(qū)、寡聚化區(qū)，所以p63被歸類為p53家族成員，但是二者之間的差異依然十分明顯。也許最主要的差異是p53在腫瘤組織中存在廣泛的突變，而p63的突變卻很少發(fā)生；p53只在應(yīng)激條件下表達(dá)水平升高，而p63在人類腫瘤組織中存在高表達(dá)，這說明p63可能比p53具有更為廣泛的功能，其表達(dá)水平的改變既足以令細(xì)胞惡變；p53的表達(dá)具有普遍性，而p63的表達(dá)卻表現(xiàn)出明顯的組織特異性，尤其是p63的兩個主要亞型的差異更為明顯。這些差異都說明p63相對于p53具有其獨(dú)特性。

由于p63基因存在多種同源體，導(dǎo)致其功能的多樣性和復(fù)雜性，這主要表現(xiàn)在TA 型和ΔN 型同源體之間存在功能上的差異性。例如：TA型同源體可以結(jié)合p53同源序列并誘導(dǎo)p53靶基因的轉(zhuǎn)錄，如p21，Bax，MDM2 等；在這方面，TAp63γ同源體表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制和發(fā)生凋亡。而TAp63α同源體由于其C未端存在抑制區(qū)域SAM，因而基本上不表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，p63基因能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，其中TAp63γ抑制其表達(dá)，而ΔNp63α則起促進(jìn)其表達(dá)，這一途徑可能是通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子HIF21α的穩(wěn)定性實現(xiàn)的[1]。由于VEGF的表達(dá)在人類腫瘤形成中起作用，因此p63還可以通過調(diào)控VEGF的表達(dá)而發(fā)揮抑癌或者原癌基因功能。同時，TAp63γ還能夠抑制內(nèi)源性表皮生長因子受體（EGFR）的表達(dá)，其機(jī)制是TAp63γ起到EGFR啟動子的轉(zhuǎn)錄抑制因子作用[2]。盡管ΔN p63不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，但是由于其具有DNA 結(jié)合域，它們可以非優(yōu)勢的方式參與DNA結(jié)合位點(diǎn)的競爭或直接與p53或TAp63結(jié)合，從而抑制p53 或TAp63的功能[3-5]。

盡管p63基因與表皮發(fā)育的關(guān)系已經(jīng)相對明確，但是p63與腫瘤的關(guān)系一直爭議較大。由于p63與p53的同源性，所以早期的研究主要集中在p63與基因組穩(wěn)定性以及凋亡的關(guān)系。在DNA損傷應(yīng)激后，p63基因表達(dá)水平增高，誘導(dǎo)凋亡，這些似乎暗示了p63可能是一個抑癌基因[6]。但是p63作為原癌基因的觀點(diǎn)也受到廣泛的關(guān)注。支持此觀點(diǎn)的主要依據(jù)是腫瘤組織中存在p63的高表達(dá)，尤其是ΔNp63在鱗癌組織中表達(dá)水平明顯增高[7,8]。而在原代培養(yǎng)的人皮膚癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TAp63的表達(dá)缺失，但是正常皮膚組織中卻存在TAp63的表達(dá)?？紤]到ΔNp63可以以顯性負(fù)控制的方式抑制p53及TAp63誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和凋亡，因此腫瘤組織中的高表達(dá)ΔNp63可能是一種選擇性優(yōu)勢，即后者可能是真正意義的原癌基因[9,10]。

本研究發(fā)現(xiàn)TAp63促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，而ΔNp63抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。這提示在胃癌細(xì)胞中，TAp63可能行使抑癌基因的功能，而ΔNp63可能行使癌基因的功能。再一次驗證了TAp63和ΔNp63的功能差異假說。

[1] Senoo M,Matsumura Y,Habus S,et al.Tap63gamma (p51A) and dNp63aipha (p73L),two major isoforms of the p63 gene,exert opposite effects on the vascular endothelial growth factor (VEGF)gene expression[J].Oncogene,2002,21(16)：2455.

[2] Hirotaka N,Makoto S,Katsura HN,et al.p53 homologue p63 represses epidermal growth factor receptor expression[J].J Biol Chem,2001,276(45)：417-417.

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[9] Liefer KM,Koster MI,Wang XJ,et al.Down-regulation of p63 is required for epidermal UV-B-induced apoptosis[J].Cancer Res,2000,60(15)：4016-4020.

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