碧血膠囊對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血的保護作用1）

劉新軍，蘇式兵

心肌缺血是冠心病最基本的病理生理過程，嚴重威脅著人類的身體健康，成為心血管病的主要致病方式。碧血膠囊是在活血化瘀驗方的基礎(chǔ)上，通過實驗篩選而確定由水蛭、三七、絞股藍等多種中藥組成的復方制劑，有活血化瘀，健脾祛痰之功效。本研究用腹腔注射異丙腎上腺素（ISO）的方法制備大鼠心肌缺血模型，觀察碧血膠囊對血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）的活性，心電圖及心肌組織病理變化的影響，探討碧血膠囊對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 MDA、SOD、LDH、CK試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所；美托洛爾（倍他樂克）片購于阿斯利康制藥有限公司（批號：0906078）；通心絡(luò)膠囊購于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司（批號：090112）；鹽酸異丙腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司（批號：20080702）；碧血膠囊（由水蛭、三七、絞股藍等組成），每粒膠囊0.43g，由上海?？松镏破酚邢薰咎峁ㄅ枺?80228）。

1.2 動物 SD大鼠70只，體重（160±20）g，雄性，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。

1.3 主要儀器 心電圖機：上海醫(yī)療電子儀器公司ECG－6511；酶標儀：BIOTEK實驗儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及用藥情況 SD大鼠70只，隨機分為7組，分別為正常對照組、模型對照組、西藥陽性對照組（倍他樂克10 mg／kg）、中藥陽性對照組（通心絡(luò)膠囊500mg／kg）、碧血膠囊高劑量組（968mg／kg）、碧血膠囊中劑量組（484mg／kg）、碧血膠囊低劑量組（242mg／kg），每組10只。將藥物溶于2mL的去離子水中，灌胃給藥。正常對照組和模型對照組給同體積去離子水，各組均每天給藥1次，連續(xù)14d。

1.4.2 ISO誘導的心肌缺血損傷模型的制備 按照Rona等[1]的方法，除正常對照組外，其余各灌胃組均于第12天、第13天、第14天灌胃給藥30min后腹腔注射ISO 5mg／kg，制備大鼠心肌缺血損傷模型。

1.4.3 心電圖的檢測 于第1次注射ISO前及最后1次注射ISO 30min后，予20% 烏拉坦麻醉大鼠，將心電圖機電極分別插入四肢皮下，記錄標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖（紙速50mm／s，定標1mV＝20mm，以PQ為基線測量），與造模前心電圖進行自身比較，按照潘志偉等[2]方法觀察T波振幅變化?！鱐（心電圖T波變化值）＝注射ISO 30min后心電圖T波高度（μV）－注射ISO前心電圖T波高度（μV）。

1.4.4 檢測血清指標 嚴格按照試劑盒說明書在BIOTEK酶標儀上測定SOD、MAD、LDH、CK的活性。

1.4.5 病理組織學觀察及判斷標準 大鼠取血后，開胸取出心臟，置于冰冷的生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片（切片厚度4mm），常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡下觀察心肌病理組織的變化情況。根據(jù)Rona等[1]和Teerlink等[3]的評分標準將心肌病理分為6級，分別對應(yīng) 0分、1分 、2分 、3分、4分、5分。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況的觀察 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，活動狀況好，有活力，叫聲響亮。模型組大鼠飲食較少，精神狀態(tài)差，不愛活動，叫聲低微。各用藥組大鼠較模型組精神狀態(tài)有所改善，食量基本正常，活動情況較模型組改善。

2.2 復方碧血膠囊對大鼠心重與體重之比的影響 模型組與正常組比較，比值明顯增高（P＜0.01）。與模型組比較，通心絡(luò)膠囊組與碧血膠囊高劑量組心重與體重比值顯著降低（P＜0.05），倍他樂克組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 復方碧血膠囊對大鼠心重與體重之比的影響（±s）

表1 復方碧血膠囊對大鼠心重與體重之比的影響（±s）

組別 劑量（mg／kg） 心重／體重（mg／g）正常組 －3.31±0.29模型組 － 3.99±0.231）通心絡(luò)膠囊組 500 3.75±0.212）倍他樂克組 10 3.91±0.19碧血膠囊低劑量組 242 3.97±0.18碧血膠囊中劑量組 484 3.89±0.29碧血膠囊高劑量組 968 3.76±0.242）與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.3 復方碧血膠囊對大鼠SOD、MDA、LDH、CK活性的影響與正常組比較，模型組大鼠SOD活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，倍他樂克組、通心絡(luò)膠囊組及碧血膠囊中、高劑量組SOD活性增高，CK、LDH活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，通心絡(luò)膠囊組與碧血膠囊中、高劑量組MDA、CK活性降低，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 復方碧血膠囊對大鼠SOD、MDA、LDH、CK活性的影響（±s）

表2 復方碧血膠囊對大鼠SOD、MDA、LDH、CK活性的影響（±s）

組別 劑量（mg／kg） SOD（U／mL） MDA（mmol／L） CK（U／mL） LDH（U／L）正常組 － 173.56±4.60 2.31±0.40 0.52±0.36 3 923.46±606.43模型組 － 164.16±3.551） 3.13±0.941） 1.24±0.791） 5 801.15±1 606.891）通心絡(luò)膠囊組 500 173.59±4.512） 2.55±0.852） 0.58±0.412） 4 508.64±1 561.162）倍他樂克組 10 174.01±3.972） 2.71±0.63 0.65±0.612） 4 407.02±1 046.89碧血膠囊低劑量組 242 170.13±2.68 2.88±0.61 0.78±0.38 4 562.22±1 792.29碧血膠囊中劑量組 484 174.07±4.092） 2.82±0.41 0.60±0.412） 4 530.90±404.082）碧血膠囊高劑量組 968 174.91±4.972） 2.51±0.632） 0.48±0.432） 4 824.44±1 258.15與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.4 對心電圖T波振幅的影響 正常組大鼠T波均未見改變，基本維持在注射前水平。模型組大鼠注射后T波高聳，各用藥組T波振幅均有不同程度的降低，以通心絡(luò)膠囊組和碧血膠囊高劑量組最為明顯。以注射ISO前后各組的T波振幅差值作比較進行統(tǒng)計分析，與正常組比較，模型組T波振幅變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），除碧血膠囊低劑量組外，各組與模型組比較，T波變化差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表3。

表3 復方碧血膠囊對大鼠血清心電圖T波的影響（±s）

表3 復方碧血膠囊對大鼠血清心電圖T波的影響（±s）

組別 劑量（mg／kg） △T段振幅（μV）正常組 －0.44±0.33模型組 － 1.74±1.021）通心絡(luò)膠囊組 500 0.69±0.643）倍他樂克組 10 1.11±0.542）碧血膠囊低劑量組 242 1.17±0.53碧血膠囊中劑量組 484 1.02±0.472）碧血膠囊高劑量組 968 0.69±0.533）與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

2.5 心肌組織的病理組織學觀察 在正常組，心肌組織結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)正常。在模型組，病理改變顯著，組織結(jié)構(gòu)紊亂，大片肌細胞崩解，消失，片狀壞死，大量單核細胞浸潤，細胞損害嚴重。在各用藥組，組織結(jié)構(gòu)病變程度好于模型組，以倍他樂克組和碧血膠囊高劑量組最為明顯，僅有少量灶形壞死和單核細胞浸潤，部分肌細胞變性、胞漿豐富、深染。以判斷標準中的六種分級方法對病理切片進行評分，結(jié)果顯示，與正常組比較造模組分值增高（P＜0.01），倍他樂克組、碧血膠囊高劑量組與模型組比較分值降低（P＜0.05）。詳見表4。

表4 復方碧血膠囊對大鼠心肌組織病理變化的影響（±s）

表4 復方碧血膠囊對大鼠心肌組織病理變化的影響（±s）

組別 劑量（mg／kg） HE染色評分（分）正常組 －0模型組 － 4.00±1.411）通心絡(luò)膠囊組 500 2.89±0.78倍他樂克組 10 2.60±1.072）碧血膠囊低劑量組 242 3.67±0.87碧血膠囊中劑量組 484 3.10±1.53碧血膠囊高劑量組 968 2.80±1.322）與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

本研究采用Rona等[1]的方法改進的采用異丙腎上腺素腹腔注射的方法造模，異丙腎上腺素作用于β受體，使心率加快，心肌收縮力增加，心輸出量和耗氧量增加，且由于舒張期過短而妨礙冠狀動脈血流灌注，從而引起心肌缺血。表現(xiàn)為SOD活力下降，MDA含量增加，CK、LDH活性增高[4]。SOD活性和MDA含量可以反映體內(nèi)氧自由基代謝水平，同時也可以作為判斷心功能及心肌受損程度的指標[5]。心肌缺血損傷可導致心肌細胞通透性增高，使一些可溶性的心肌酶類大量釋放到血液中，從而使血清心肌酶的含量顯著升高，故常通過檢測血清心肌酶含量以判斷心肌受損情況[6]。心電圖是檢測心血管疾病的重要手段之一。心電圖多表現(xiàn)為T波高聳，ST－T段下降，QRS波群增寬、振幅降低[7]。由于大鼠心電圖缺乏ST－T段的特點，常將T波變化值作為評價心肌缺血損傷程度的重要指標[8]。病理切片表現(xiàn)為心肌增生肥大，炎癥細胞浸潤，膠原組織增生，甚至組織壞死[9]。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清LDH、CK、MDA活性增高，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。T波高聳，心肌組織病理可見大片細胞死亡，大量炎細胞浸潤，說明心肌缺血模型成立。

心肌缺血在中醫(yī)中稱之為胸痹，其主要病機為心氣不足，心血瘀阻，痰濁凝滯，脈管阻塞，不通則痛，故基本病機為心脈不通，治則多以活血化瘀藥物為主。碧血膠囊是由三七、水蛭、絞股藍等組成。絞股藍能提高缺血再灌注心肌SOD活性，降低MDA水平[10]。三七的主要成分三七總皂甙能夠顯著減輕異丙腎上腺素所致的大鼠心肌缺血病理損傷程度[11]。還可降低血清肌酸激酶同工酶（CK－MB），心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕；TUNEL心肌凋亡陽性細胞數(shù)減少[12]。水蛭素可顯著降低缺血心肌內(nèi)白細胞聚集，降低梗死面積，減輕心肌再灌注損傷[13]。然而，由三七、水蛭、絞股藍等組成的中藥復方對心肌缺血缺氧的影響，尚未見有研究報道。

作為陽性對照藥物的倍他樂克是β受體阻滯劑，可以抑制異丙腎上腺素的作用[14]，也是臨床常用藥物。通心絡(luò)膠囊可以抑制缺血再灌注的心肌細胞凋亡[15]，還可以影響垂體后葉素所誘導的急性心肌缺血的心電圖變化，抑制CK－MB、肌鈣蛋白I（TnI）、肌紅蛋白（Myo）的升高。提高血清SOD活性、降低MDA含量[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)在異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血模型中，倍他樂克和通心絡(luò)膠囊具有降低心肌酶的活性，降低T波振幅，改善心肌組織病變的作用。

本實驗結(jié)果顯示，碧血膠囊可以明顯增高心重與體重的比值（P＜0.05），顯著降低血清LDH、CK、MDA活性（P＜0.05），并顯著增加SOD活性（P＜0.05），且能使T波振幅降低。心肌組織病變明顯改善。降低心重與體重的比值，降低血清酶的活性和降低T波振幅方面優(yōu)于倍他樂克，與通心絡(luò)膠囊作用相似。但在改善心肌組織病理方面不如倍他樂克。

通過降低心重與體重的比值，提示碧血膠囊可以減輕心肌肥厚的程度，減輕心臟負荷。通過對SOD、MDA活性的影響，提示碧血膠囊可能干預(yù)自由基的產(chǎn)生并增強自由基清除劑的功能，維持心肌細胞氧化和抗氧化平衡，阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈鎖反應(yīng)，發(fā)揮了抗心肌缺血損傷作用。通過降低LDH、CK等心肌酶，減少心肌細胞的死亡和炎癥細胞的浸潤，降低T波振幅，提示碧血膠囊可以減輕異丙腎上腺素所致的心肌損害。因此，可以改善心肌的收縮功能，改善心肌缺血。通過對病理組織的分析，也證實碧血膠囊確實可以改善組織病變。

總之，碧血膠囊對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血具有保護作用，其通過影響氧自由基和心肌酶改善心肌缺血的作用機制有待進一步研究。

[1]Rona G，Chappel CI，Balazs T，et al.An infarct－like myocardial lesion and other toxic manifestation produced by isoproterenal in the rat[J].Arch Pathol，1959，67（4）：443－455.

[2]潘志偉，王秋娟，楊涓，等.淫羊藿苷對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血的影響[J].中國藥理學通報，2007，23（5）：622－625.

[3]Teerlink JR，Pfeffer JM，Pfeffer MA.Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol－induced myocardial necrosis in rats[J].Circ Res，1994，75：105－113.

[4]Yuan J，Wu J，Hang ZG，et al.Role of peroxisome proliferator－activated receptorαactivation in acute myocardial damage induced by isoproterenol in rats[J].Chin Med J，2008，121（16）：1569－1573.

[5]江一清，劉朝中，朱國英.現(xiàn)代冠心病學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：192－194.

[6]楊庭樹.冠心病實驗診斷學[M].北京：科學技術(shù)文獻出版社，2002：275－291.

[7]Heidi L，Victoria J.Sex influences the susceptibility to reperfusion－induced sustained ventricular tachycardia andβ－adrenergic receptor blockade in conscious rats[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293：H2799－H2808.

[8]方偉蓉，李運曼，鄧嘉元.龍血竭總黃酮對動物心肌缺血的保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10（9）：1020－1024.

[9]Huan Wang，Emily AO，Naoya M，et al.Modulatesβ－adrenergic receptor－dependent cardiac contraction and inhibits cardiac hypertrophy[J].Circ Res，2005，97：1305－1313.

[10]譚華炳，趙世印，賀琴.絞股藍心血管相關(guān)藥理作用研究及組方臨床應(yīng)用[J].中藥研究與信息，2005，7（4）：23－25.

[11]張騰，盛小禹，劉亞和，等.三七總皂甙對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血基因表達譜影響的探討[J].中國藥物與臨床，2003，3（3）：229－233.

[12]顧國嶸，黃培志，葛均波，等.缺血及三七總皂甙預(yù)處理對心肌缺血－再灌流損傷的保護作用[J].中華急診醫(yī)學雜志，2005，14（4）：307－309.

[13]冷立娟，楊欣國，李波，等.重組水蛭素通過降低白細胞浸潤減輕心肌缺血再灌注損傷[J].第四軍醫(yī)大學學報，2004，25（8）：712－714.

[14]Dario L，Giuseppe R，Guido I，et al.Exercise training andβ－blocker treatment ameliorate age－dependent impairment ofβ－adrenergic receptor signaling and enhance cardiac responsiveness to adrenergic stimulation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293：H1596－H1603.

[15]趙明中，高承梅，楊紅.通心絡(luò)膠囊對大鼠實驗性心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，21：7－8.

[16]陳漢想，劉立，彭超華.通心絡(luò)膠囊預(yù)防垂體后葉素致實驗性大鼠急性心肌缺血的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（17）：2530－2532.