核桃醬油制曲條件的優(yōu)化*

藺立杰，趙媛，王建中，王豐俊

(北京林業(yè)大學食品科學與工程系，北京，100083)

核桃醬油制曲條件的優(yōu)化*

藺立杰，趙媛，王建中，王豐俊

(北京林業(yè)大學食品科學與工程系，北京，100083)

以核桃粕為蛋白質原料，中性蛋白酶活力為指標，對制曲工藝進行了研究。通過單因素試驗分別研究了核桃粕含量、潤水量、蒸料時間、制曲時間對成曲蛋白酶活力的影響。并在單因素試驗的基礎上，采用4因素3水平的響應面分析，考慮實際試驗條件，得出適宜制曲工藝條件:核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時間32 min，制曲時間32.9 h。在此條件下蛋白酶活力均值為1002.87U/g干基。

核桃粕，響應面法，制曲，中性蛋白酶活

醬油是我國傳統(tǒng)的釀造調味品，營養(yǎng)豐富且風味獨特，含有多種氨基酸、有機化合物和礦物質[1］。目前，釀造醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質原料為輔料，經米曲霉制曲、發(fā)酵釀制而成[2］。制曲是醬油生產的基礎，制得高品質的成曲是生產出優(yōu)質醬油的先決條件[3］，成曲的好壞直接影響醬油的品質。成曲質量可以通過顏色、曲味等感官因素評定，中性蛋白酶是米曲霉生長過程主要分泌的蛋白酶，其活力高低受米曲霉所利用的曲料及生長環(huán)境的影響[4］，可作為成曲質量評定的主要理化指標。

核桃位居世界四大堅果之首[5］，具有很高的食用價值，資源豐富，是傳統(tǒng)的食品加工原料[6-7］。核桃粕是核桃經過物理壓榨提取出大部分油脂后剩下的部分，蛋白含量可達到40%左右[8］，在核桃蛋白中含有18種氨基酸，有8種必需的氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量較高[9］，而核桃蛋白制品品種單一，主要有核桃粉、濃縮蛋白、分離蛋白、蛋白肽等[10］。以榨油后的核桃粕為蛋白原料生產核桃醬油，蛋白含量充足且利用率很高[8］。既為核桃的綜合利用提供了廣闊的前景，利于提高核桃粕附加值，又為生產營養(yǎng)醬油提供了方向。本研究采用核桃粕取代傳統(tǒng)的大豆制曲，以中性蛋白酶活力為指標，通過單因素試驗和響應面法對制曲工藝進行優(yōu)化，以獲得最佳的制曲條件，為進一步的研究工作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料

核桃粕，由河北晶品果業(yè)有限公司提供，油脂含量為32%;麩皮，購于北京本鄉(xiāng)面粉廠。

1.1.2 菌種

滬釀3.042:北京林業(yè)大學微生物系提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲霉斜面培養(yǎng)基:采用PDA培養(yǎng)基。

種曲培養(yǎng)基[11］:按照 m(麩皮)∶m(豆粕)=4∶1的比例在250 mL三角瓶中加入20 g過10目篩的干料，12 g蒸餾水，拌勻。121℃，0.1 MPa滅菌30 min。

1.1.4 試劑

酪蛋白，國藥集團化學試劑有限公司;酪氨酸，北京奧博星生物技術有限責任公司;福林試劑，北京鼎國生物技術有限公司;其他試劑皆為分析純。

1.1.5 儀器

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;B-260型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠;752型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;SW-CJ-1F型潔凈工作臺，蘇州凈化設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 單因素試驗

以成曲中性蛋白酶活力為評價指標，研究核桃粕含量、潤水量、蒸料時間和制曲時間對酶活力的影響。

1.2.3 響應面法設計

在單因素試驗的基礎上，運用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以核桃粕含量、潤水量、蒸料時間、制曲時間為研究對象進行4因素3水平的響應面分析，對制曲條件進行優(yōu)化。

1.3 分析方法

1.3.1 成曲水分的測定

參照ZB/X 66025-1987水分測定法。

1.3.2 蛋白酶活力測定

采用福林法，參照SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

酪氨酸標準曲線回歸方程為 y=97.672x-0.9361，R2=0.9997，酪氨酸濃度在 0～100 μg/mL內，線性關系良好。

2.2 制曲條件單因素試驗結果與分析

2.2.1 核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響

潤水量100%，蒸料時間30 min，制曲時間32 h時，核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖2。

圖1 核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖1可以看出，在核桃粕含量在50%即核桃粕與麩皮質量比為1∶1時，中性蛋白酶活力最佳，增加核桃粕含量，蛋白酶活力下降。原料中的蛋白質對米曲霉產生蛋白酶有誘導作用，誘導作用與其含量、種類都有關系。不同原料營養(yǎng)成分不同，微生物利用原料的難易程度也存在差別[12］，蛋白酶活力隨著質量比增加而減小，可能跟核桃粕和麩皮組分含量不同，導致其中營養(yǎng)成分利用難易程度不同有關。

2.2.2 潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，蒸料時間30 min，制曲時間32 h時，潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖3。

圖2 潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖2看出，隨著潤水量的增加，中性蛋白酶活力逐漸增大，潤水量為120%時，中性蛋白酶活力達到最大值。低水分時，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質溶解性差;但水分過高，會因物料吸水膨脹使得氧氣的傳輸受抑制，供氧效果減弱，影響到米曲霉蛋白酶的分泌，造成酶活力下降。而且水分含量過大，雜菌污染的機率會相應增大[13］。因此，原料的潤水量以120%為宜。

2.2.3 料時間對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，潤水量100%，制曲時間32 h時，蒸料時間對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 蒸料時間對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖3可以看出，隨著蒸料時間的延長，蛋白酶活力相應增大，在30 min時蛋白酶活力達到最佳。時間的繼續(xù)延長，蛋白酶活呈下降趨勢。蒸料處理的目的是使蛋白質的次級鍵遭到破壞，露出肽鍵，這種構型具有一定的水溶性，對米曲霉具有誘導作用[14］。在30 min之前核桃粕中蛋白質變性不足，而在30 min之后蛋白質過度變性，此時蛋白質的構象都會使米曲霉生長代謝受抑制，蛋白酶活力減小。另外，考慮到能效問題，故蒸料時間選取30 min。

2.2.4 制曲時間對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，潤水量100%，蒸料時間30 min時，制曲時間對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 制曲時間對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖4可以看出，在制曲時間32h之前，米曲霉處于生長初期，中性蛋白酶活力呈上升趨勢，隨著時間的繼續(xù)米曲霉已過生長、成熟的階段，處于生長后期，蛋白酶活力開始下降。因此，制曲時間以32h為宜。

2.3 制曲條件響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗設計

結合單因素試驗結果，以核桃粕含量(X1)、潤水量(X2)、蒸料時間(X3)、制曲時間(X4)作為試驗因素設計實驗，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素及水平

2.3.2 回歸方程的建立及檢驗

根據Box-Behnken中心組合設計進行了29組試驗，其中24組析因點，5組中心點，結果見表2。

將表2的數據使用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合分析得回歸方程為:

對模型進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

由表3方差分析可知，模型 Prob＞F值小于0.01，表明回歸方程是極顯著的。失擬項的Prob＞F值大于0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占的比例小，表示所得回歸方程是好的[15］。同時模型相關系數R2=0.9615，說明該方程能夠很好地反映響應值，因此，可以用此模型方程對制曲條件進行預測分析。

2.3.3 因素影響程度分析

通過表3中:F(X1)=103.10，F(X2)=6.92，F(X3)=0.053，F(X4)=0.61，得各因素對制曲條件的影響程度由大到小為:核桃粕含量＞潤水量＞制曲時間＞蒸料時間。由顯著性檢驗得:試驗中 X1X2、X2X3、X3X4對中性蛋白酶活力的影響極顯著，X1X3對中性蛋白酶活力的影響顯著，即核桃粕含量和潤水量的交互作用，潤水量和蒸料時間的交互作用、蒸料時間和制曲時間的交互作用影響極顯著，核桃粕含量和蒸料時間的交互作用影響顯著，它們之間的交互作用響應面圖見圖5～圖8，其他因素間交互作用影響不顯著(未列出)。

表3 回歸方程方差與顯著性分析

圖5 核桃粕含量與潤水量交互影響中性蛋白酶活力的響應面圖

圖6 潤水量與蒸料時間交互影響中性蛋白酶活力的響應面圖

從圖5～圖8可看出，核桃粕含量與潤水量對中性蛋白酶活力的交互作用影響最大，潤水量與蒸料時間交互作用次之，蒸料時間與制曲時間交互作用再次，核桃粕含量與蒸料時間的交互作用影響最小。

圖7 蒸料時間與制曲時間交互影響中性蛋白酶活力的響應面圖

圖8 核桃粕含量與蒸料時間交互影響中性蛋白酶活力的響應面圖

2.3.4 響應面優(yōu)化及驗證

依據Design Expert軟件進行優(yōu)化配置，得到最佳酶活力時四因素編碼值依次為:X1=0.509，X2=-0.351，X3=0.441，X4=0.223。也就是在核桃粕含量55.09%，潤水量112.98%，蒸料時間32.205 min，制曲時間32.892 h時，得到蛋白酶活力最大預測值的1014.56 U/g干基。考慮實際操作條件，將上述最佳制曲條件修正為核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時間32 min，制曲時間32.9 h，該條件下平行3次測中性蛋白酶活力均值為1002.87 U/g干基，相對誤差為1.15%。

3 結論

本試驗在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對核桃醬油制曲工藝進行了優(yōu)化，得到了核桃醬油制曲工藝的二次回歸模型方程，并進一步確定了制曲的最佳工藝條件為:核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時間32 min，制曲時間32.9 h。在此工藝條件下，進行3次平行試驗，所得成曲中性蛋白酶活力均值達1002.87 U/g干基，相對誤差為1.15%。試驗結果表明采用核桃粕制作醬油曲是可行的，這為后續(xù)制取核桃醬油提供了基礎，拓展了核桃粕的利用途徑。

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ABSTRACTOptimization of Koji-making Technology for Preparing Walnut Soy SauceThe koji-making technology was studied with the activity of neutral protease as index and walnut meal as raw protein material.The single factor experiment was used to investigate the effects of ratio of walnut meal，moisture content，steaming time and koji-making time on the activity of neutral protease.Based on single factor experiments，the koji-making technology was optimized by response surface methodology with four factors and three levels.The results showed the optimum koji-making conditions were as follows:the content of walnut meal was 55%，moisture content was 113%，steaming time was 32 min，time for koji-making was 32.9h.Under such conditions，the activity of proteases reached1002.87 U/g.

Key wordswalnut meal，response surface method，koji-making，the activity of neutral protease

Optimization of Koji-making Technology for Preparing Walnut Soy Sauce

Lin Li-jie，Zhao Yuan，Wang Jian-zhong，Wang Feng-jun
(Department of Food Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

碩士(王豐俊副教授為通訊作者)。

*國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項資助項目(20100400706)

2012-01-11，改回日期:2012-03-26