活性污泥中1株產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的分離與鑒定*

馬忠友，汪建飛，祝嫦巍，吳萍

1(安徽科技學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽，233100)

2(安徽科技學(xué)院，城建與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽，233100)

活性污泥中1株產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的分離與鑒定*

馬忠友1，汪建飛2，祝嫦巍1，吳萍1

1(安徽科技學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽，233100)

2(安徽科技學(xué)院，城建與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽，233100)

從污水處理廠等活性污泥樣品中分離到了19株絲狀細(xì)菌，通過蘇丹黑染色法和紫外吸收光譜掃描技術(shù)證明這些絲狀細(xì)菌能夠在菌體內(nèi)積累聚β-羥基丁酸(PHB)。采用氯仿乙醇法提取PHB，并采用紫外吸收法進(jìn)行定量測定，篩選出1株高產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌HY10，細(xì)胞PHB含量為(37.24±0.74)%，PHB產(chǎn)量為1.15±0.06 g/L。綜合該菌株的菌落形態(tài)和16S rDNA序列(GenBank No.JQ353768)分析結(jié)果將HY10菌株鑒定為假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)。

聚β-羥基丁酸，絲狀細(xì)菌，假蕈狀芽孢桿菌

隨著塑料制品的廣泛使用，廢棄的化學(xué)塑料由于不能被微生物分解，帶來了嚴(yán)重的“白色污染”。聚β-羥基丁酸(PHB)是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積累的一種能被微生物酶所降解的高分子聚合物。PHB的性質(zhì)與目前普遍使用的合成塑料有許多相似之處，例如可壓塑、成膜和拉絲等，此外，它還具有生物可降解性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)尤其在組織工程上，具有重要的作用。因此，PHB作為一種新型的塑料替代品以及生物醫(yī)學(xué)材料，已經(jīng)成為人們的研究熱點(diǎn)[1］。Lemoigne于1926年首先在巨大芽孢桿菌(Baillus megatheriucm)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PHB，能產(chǎn)生PHB的微生物分布極廣，包括光能和化能自養(yǎng)及異養(yǎng)菌，共65個屬中的近300種微生物。目前研究得較多用于合成PHB的微生物有:產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，假單胞菌屬(Pseudonomas)，甲基營養(yǎng)菌(Methylotrophs)，固氮菌屬(Azotobacter)和紅螺菌屬(Rhodospirillum)等，它們能分別利用不同的碳源合成不同的PHAs。其中以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的研究最多，也最成熟，已經(jīng)能夠小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) PHB 和 PHBV[1-2］。

絲狀細(xì)菌主要分布在水生環(huán)境、潮濕土壤和活性污泥中，該類細(xì)菌能在胞內(nèi)積累含量較高的PHB顆粒，而且它們對污水中的有機(jī)物和有毒物質(zhì)有很強(qiáng)的降解能力，在污水處理過程中發(fā)揮著重要的作用[3］。如果能以工廠污水為原料，利用絲狀細(xì)菌來生產(chǎn)PHB，一方面將有可能大大降低PHB的生產(chǎn)成本，另一方面又使污泥得到了合理利用。本研究采用低營養(yǎng)培養(yǎng)基，通過富集培養(yǎng)和紫外吸收光譜測定技術(shù)，從活性污泥中分離、篩選到了1株高產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌，并通過16S rDNA測序技術(shù)對該菌株進(jìn)行了分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

蚌埠市第一污水處理廠活性污泥、安徽科技學(xué)院校內(nèi)排水溝污泥、鳳陽城區(qū)居民排水溝污泥和面粉廠排污處污泥。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

聚 β-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國，Sigma-aldrich)，其他實(shí)驗(yàn)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

尿素富集培養(yǎng)基(g/L):尿素0.5，葡萄糖1.0，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.1，自來水定容至1L，pH 7.0～7.2，115℃滅菌30 min。

Stoke分離純化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.05，F(xiàn)eCl30.01，自來水定容至1L，pH 7.0～7.2，瓊脂20，115℃滅菌30 min[3］。

產(chǎn)PHB基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨 3，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.05，F(xiàn)eCl30.01，K2HPO40.04，KH2PO40.03，NaH2PO4·2H2O 0.05，H3BO30.005，蒸餾水定容至1L，pH 7.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶50mL，115℃滅菌30 min。

1.2.2 顯微染色觀察

按常規(guī)制成涂片，以0.3%蘇丹黑 B染色10 min，水沖去染劑，用濾紙吸將水吸干，再用二甲苯?jīng)_洗至無色素，然后用0.5%番紅復(fù)染1 min，水洗，吸干，鏡檢。PHB顆粒染成黑綠色，菌體其他部分呈紅色[4］。

1.2.3 產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的分離、純化

取活性污泥5 g接種于100 mL已滅菌的富集培養(yǎng)液(尿素培養(yǎng)基)中，30℃搖床培養(yǎng)1天，再靜止培養(yǎng)1天。待長出漂浮于液體中的半透明絮狀物時，挑取絮狀物，經(jīng)蘇丹黑染色顯微鏡鏡檢有PHB顆粒后，再挑取絮狀物移入新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

挑取少量經(jīng)過多次富集后得到的絮狀物，在Stoke平板上劃線分離，30℃培養(yǎng)2天，見有絲狀體伸展時，挑取絮狀物，經(jīng)蘇丹黑染色顯微鏡鏡檢有PHB顆粒后，及時用接種針挑取菌體在Stoke平板上劃線。經(jīng)過3～4次的重復(fù)劃線后，既可得純菌落。

1.2.4 PHB的紫外吸收光譜掃描定性分析

準(zhǔn)確稱取0.01 g干菌體，放入干凈的帶刻度的試管中，加入20 mL V(三氯甲烷)∶V(乙醇)=2∶1，溶液，于60℃的水浴鍋內(nèi)水浴抽提1 h，接著過濾，取濾液0.2 mL加入另一批干凈的試管中，放入干燥箱內(nèi)蒸發(fā)掉氯仿和乙醇，然后加入10 mL濃H2SO4，100℃中水浴10 min，冷卻并混勻，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描檢測[3］。

1.2.5 PHB定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

PHB在濃H2SO4中加熱時可以定量地轉(zhuǎn)化為巴豆酸(反-2-丁烯酸)。根據(jù)巴豆酸在235 nm處有一最大吸收峰值，而其它含碳化合物在同樣條件下的吸收峰與PHB有很大的差別，建立適用于PHB含量測定的PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用電子天平準(zhǔn)確稱取0.01 g PHB標(biāo)準(zhǔn)品，加入20 mL三氯甲烷，混勻，于60℃水浴30 min，使其充分溶解，PHB濃度為500 μg/mL。從中吸取2 mL，加入198 mL氯仿，混勻溶解，PHB 濃度為5μg/mL，再從該溶液中分別吸取 1，2，3，4，5，6，7 mL 加入 7 支干燥的帶塞帶刻度的干凈試管中(每個濃度各3支)，使其中 PHB 的質(zhì)量分別為 5，10，15，20，25，30，35 μg。加熱除去三氯甲烷，加入10 mL濃H2SO4，試管口用玻璃片蓋住，在100℃水浴中加熱10 min，冷卻，并充分混勻。然后用濃H2SO4作空白對照，在紫外可見分光光度計(jì)的235 nm處測OD值。以PHB濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖，即可得到PHB濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線[5］，如圖1 所示。

圖1 PHB的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6 產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的篩選

將獲得的產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌接種于液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株設(shè)置3個重復(fù)。30℃進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)2天，8000 r/min離心發(fā)酵液，棄去上清液，洗滌沉淀物，得濕菌體于60～70℃下烘干。稱細(xì)胞干重，測PHB的含量，計(jì)算各菌株P(guān)HB的產(chǎn)量，篩選出高產(chǎn)PHB的菌株。

1.2.7 PHB含量的測定

采用氯仿乙醇法提取菌體胞內(nèi)的PHB，經(jīng)濃硫酸處理后，用紫外可見分光光度計(jì)在235 nm處測OD值，并通過PHB定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量及產(chǎn)量[3］。

1.2.8 產(chǎn)PHB細(xì)菌的分類鑒定

菌株16S rDNA區(qū)域的擴(kuò)增采用菌液PCR法，擴(kuò)增引物采用27F(5'– AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')和 1492R(5'– GGTTACCTTGTTACGACTT –3')。

表1 PCR擴(kuò)增體系

擴(kuò)增反應(yīng)在美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的PCR儀上進(jìn)行。

擴(kuò)增程序:94℃變性5 min，(94℃變性1min，52℃退火1 min，72℃延伸1min)×30，72℃延伸 10 min，4℃保溫。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被送到上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.9 系統(tǒng)樹的構(gòu)建

為研究供試菌株與已知細(xì)菌的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，在GenBank上下載相關(guān)近緣種細(xì)菌菌株的16S rDNA區(qū)域序列與供試菌株的序列放在一起，用BioEdit軟件進(jìn)行匹配排列，使用MEGA4.1軟件，并采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建分支系統(tǒng)樹和Bootstrap analysis方法進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的分離

從不同地點(diǎn)采集到的污泥樣品，經(jīng)過三角瓶富集培養(yǎng)，結(jié)合平板劃線和蘇丹黑染色顯微鏡檢法，成功分離到了19株產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌。結(jié)果表明，蚌埠市第一污水處理廠活性污泥、本校排水溝污泥、鳳陽城區(qū)居民排水溝污泥、鳳陽郊區(qū)面粉廠排污處污泥均分離到了絲狀細(xì)菌。不同地點(diǎn)的污泥樣品中所含產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的數(shù)量不同，其中以蚌埠市第一污水處理廠活性污泥最多，共分離到10株。絲狀細(xì)菌HY10菌株的菌落和胞內(nèi)積累的PHB顆粒如圖2所示。

圖2 絲狀細(xì)菌HY10

2.2 PHB的紫外光譜掃描定性分析

采用氯仿乙醇法提取菌體胞內(nèi)物質(zhì)，將所獲得的白色粉末或薄膜狀樣品經(jīng)濃硫酸處理后，在200～800 nm利用島津UV-2550紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描檢測，并以濃H2SO4做空白對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃H2SO4處理產(chǎn)物在235 nm處有一最大吸收峰值(圖3)，這與PHB標(biāo)準(zhǔn)品在熱濃硫酸中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物——巴豆酸(反-2-丁烯酸)的最大吸收值一致。

圖3 PHB的紫外掃描光譜圖

2.3 產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的篩選

將分離純化得到的19株產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)2天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。經(jīng)比較，編號為HY10的菌株細(xì)胞干重為3.08±0.12 g/L，PHB含量為(37.24±0.74)%，PHB產(chǎn)量為1.15±0.06 g/L，PHB的含量和濃度均為最高，而細(xì)胞干重也較高，故選擇HY10菌株作為進(jìn)一步研究的菌株。

表1 不同絲狀細(xì)菌PHB產(chǎn)量的比較

2.4 產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌的分類鑒定

采用菌液PCR法擴(kuò)增HY10菌株的16S rDNA序列，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，如圖4所示，長度約1500 bp。

圖4 HY10菌株16S rDNA序列PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

根據(jù)HY10菌株的16S rDNA序列(GenBank No.JQ353768)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，結(jié)果顯示HY10菌株和假蕈狀芽孢桿菌Bacillus pseudomycoides NBRC 101232(Gen-Bank No.AB681414)、B.pseudomycoides DSM 12442(GenBank No.AM747226)的16S rDNA區(qū)序列完全相同，相似性為100%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)菌株蠟狀芽孢桿菌B.cereus IAM 12605T(GenBank No.D16266)、巨大芽孢桿菌 B.megaterium IAM 13418T(GenBank No.D16273)、蕈狀芽孢桿菌 B.mycoides DSM 2048T(GenBank No.X55061)、B.mycoides DSM 2048T(GenBank No.AB592538)、枯草芽孢 桿 菌 B.subtilis NCDO 1769T(GenBank No.X60646)、假蕈狀芽孢桿菌 B.pseudomycoides NBRC 101232(GenBank No.AB681414)、B.pseudomycoides DSM 12442(GenBank No.AM747226)、B.pseudomycoides GTC 02831(GenBank No.AB592542)、B.pseudomycoides NRRL B-617T(GenBank No.AF013121)和大腸桿菌Escherichia coli ATCC 11775T(GenBank No.X80725)的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，HY10菌株和假蕈狀芽孢桿菌 B.pseudomycoides聚在一組，概率99%。因此綜合HY10菌株的形態(tài)特征(圖1)和16S rDNA序列，把該菌株鑒定為假蕈狀芽孢桿菌Bacillus pseudomycoides Nakamura[6］。

3 討論

圖5 芽孢桿菌屬部分菌株的16S rDNA序列分支系統(tǒng)樹

絲狀細(xì)菌的比表面積大，有利于攝取低濃度底物，在底物濃度相對較低的條件下比其他細(xì)菌增殖速度快。根據(jù)這個特點(diǎn)，很多絲狀細(xì)菌被從樣品中分離出來，如浮游球衣菌 Sphaerotilus natans[7，8］和蕈狀芽孢桿菌B.mycoides[9］等。本研究從不同來源的活性污泥中分離到了19株產(chǎn)PHB絲狀細(xì)菌，由于所在的環(huán)境條件不同，其積累PHB的能力也不同。從污水處理廠活性污泥分離到的假蕈狀芽孢桿菌B.pseudomycoides HY10菌株的生長能力和PHB產(chǎn)量最高，這可能與污水處理廠常年處理不穩(wěn)定的不同性質(zhì)的污水有關(guān)，因?yàn)镻HB在環(huán)境壓力和營養(yǎng)不平衡的條件下更容易被微生物合成[10］。

通過核磁共振波譜技術(shù)研究顯示，生物可降解塑料聚羥基脂肪酸酯有聚β-羥基丁酸(簡稱PHB)、聚β-羥基戊酸(簡稱 PHV)和聚 β-羥基己酸(簡稱PHH)等多種類型[4，11-15］，此外，在一定條件下2種或2種以上的單體還能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV組成的共聚物P(3HB-co-3HV)，又寫成PHBV[10，16］。在培養(yǎng)基中加入不同的單體(例如:3-羥基戊酸鹽，3-羥基丁酸鹽，3-羥基己酸鹽等)，進(jìn)行多樣性的組合，改變其性能，可以產(chǎn)生巨大的高分子生物聚合物。從圖3中可以看出除了在235 nm處有一最大吸收峰，PHB標(biāo)準(zhǔn)品在303 nm處有一較弱的吸收峰，而假蕈狀芽孢桿菌HY10胞內(nèi)PHB在319 nm處有一較弱的吸收峰，說明假蕈狀芽孢桿菌HY10胞內(nèi)PHB的單體和3-羥基丁酸有差異，可能具有新的基團(tuán)，有待于利用紅外光譜和核磁共振技術(shù)進(jìn)一步研究。

[1]Khanna S，Srivastava A K.Recent advances in microbialpolyhydroxyalkanoates[J］.Process Biochemistry，2005，40(2):607-619.

[3]陳接鋒，許旭萍，余晨興，等.合成聚 β-羥基丁酸(PHB)鞘細(xì)菌的分離、鑒定與篩選[J］.工業(yè)微生物，2003，33(4):23-26，31.

[4]Legat A，Gruber C，Zangger K，et al.Identification of polyhydroxyalkanoates in Halococcus and other haloarchaeal species[J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87(3):1119-1127.

[5]Law J H，Slepecky R A.Assay of poly-β-hydroxybutyric acid[J］.Journal of Bacteriology，1961，82:33-36.

[6]Nakamura L K.Bacillus pseudomycoides sp.nov[J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48(3):1031-1035.

[7]許旭萍，陳接鋒，李惠珍.Sphaerotilus natans FQ40合成聚β-羥基丁酸(PHB)條件的研究[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(9):23-26.

[8]張立新，王錦平，郭秀君，等.從球衣細(xì)菌中分離提取PHB的研究[J］.微生物學(xué)雜志，1993，13(1):30-33.

[9]Borah B，Thakur P S，Nigam J N.The influence of nutritional and environmental conditions on the accumulation of poly-β-hydroxybutyrate in Bacillus mycoides RLJ B-017[J］.Journal of Applied Microbiology，2002，92(4):776-783.

[10]López-Cortés A，Lanz-Landázuri A，García-Maldonado，J.Screening and isolation of PHB-producing bacteria in a polluted marine microbial mat[J］.Microbial Ecology，2008，56(1):112-120.

[11]Thirumala M，Reddy S，Mahmood S.Production and characterization of PHB from two novel strains of Bacillus spp.isolated from soil and activated sludge[J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2010，37(3):271-278.

[12]Reddy S V，Thirumala M，Mahmood S K.A novel Bacillussp.accumulating poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)from a single carbon substrate[J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36(6):837-843.

[13]Tajima K，Igari T，Nishimura D，et al.Isolation and characterization of Bacillus sp.INT005 accumulating polyhydroxyalkanoate(PHA)from gas field soil[J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，95(1):77-81.

[14]Kung S S，Chuang Y C，Chen C H，et al.Isolation of polyhydroxyalkanoates-producing bacteria using a combination of phenotypic and genotypic approach[J］.Letters in Applied Microbiology，2007，44(4):364-371.

[15]陳宏，方東升，陳秉良.聚-β-羥基丁酸產(chǎn)生菌NS-82#的研究[J］.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28(4):27-31.

[16]Reddy S V，Thirumala M，Reddy T K，et al.Isolation of bacteria producing polyhydroxyalkanoates(PHA)from municipal sewage sludge[J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(12):2949-2955.

ABSTRACT19 strains of filamentous bacteria that accumulated poly-β-hydroxybutyrate(PHB)were isolated from activated sludge by enrichment cultivation.Staining with Sudan Black B was applied to detect PHAs.Quantitative estimation of PHB extracted from the isolates was done by Ultraviolet spectrophotometer method.PHB was extracted from these strains through the CHCl3-CH3CH2OH method.The PHA productivities of strain HY10 was the highest in 19 isolates mentioned above，in which PHB yield and productivities were(37.24 ±0.74)%dry cell weight(DCW)and 1.15±0.06 g/L，respectively when grown in a medium containing 20 g/L sucrose.According to its clone morphological and the 16S rDNA sequence(GenBank No.JQ353768)，it suggested that strain HY10 was Bacillus pseudomycoides.

Key wordspoly-β-hydroxybutyrate，filamentous bacteria，Bacillus pseudomycoides

Isolation and Characterization of Filamentous Bacteria HY10 Accumulating Poly-β-hydroxybutyrate(PHB)from Activated Sludge

Ma Zhang-you1，Wang Jian-fei2，Zhu Chang-wei1，Wu Ping1
1(College of life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)
2(College of Urban Construction ＆ Enviroment Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

博士，講師(汪建飛教授為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金(31100070);安徽科技學(xué)院穩(wěn)定人才基金(2RC2011299);安徽科技學(xué)院生物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科(AKXK20102-1);安徽農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金(10140306017)

2012-01-07，改回日期:2012-02-02