肺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的研究進展

沈誠 車國衛(wèi)

腫瘤演進的各個階段均與其周圍的環(huán)境進行交互對話（cross-talk），從而形成腫瘤-宿主界面微環(huán)境（microenvironment of the tumor-host interface）。但目前的研究與治療主要集中在“種子-癌細(xì)胞”上，而對于“土壤-腫瘤微環(huán)境”中的分子機理了解甚少。然而，針對“種子-癌細(xì)胞”的“毒藥”治療效果差，迫使人們不得不重視對“土壤”的研究，以期為腫瘤的治療開辟新的途徑?，F(xiàn)有研究[1]表明成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換也發(fā)生在組織的創(chuàng)傷和炎癥修復(fù)過程中，且這種持續(xù)的刺激能促進上皮細(xì)胞的增生并最終形成癌細(xì)胞，癌細(xì)胞又進一步促進成纖維細(xì)胞表型變化。一般認(rèn)為成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換是癌細(xì)胞分泌各種因子作用的結(jié)果，目的是創(chuàng)造一種適應(yīng)或利于腫瘤生長、演進的微環(huán)境，即腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）[1]。研究癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）表型和功能上轉(zhuǎn)換的分子機制，有助于更好地了解腫瘤的生長環(huán)境，并有望成為腫瘤治療的新靶點。

1 CAFs來源及其異質(zhì)性

1.1 CAFs的來源及其形態(tài)學(xué)特征 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞具有成肌纖維細(xì)胞（myofibroblasts, MF）的特性，其特征性的表型標(biāo)記有α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast-activating protein, FAP）、波形蛋白（Vimentin）。CAFs的主要來源有：①由宿主殘存間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞在癌細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）和血小板衍生因子（platelet-derived growth factor, PDGF）作用下誘導(dǎo)分化形成[2]；②上皮性腫瘤細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）轉(zhuǎn)化而來[3]；③CAFs與血管平滑肌細(xì)胞和血管外膜細(xì)胞有極大的相似性，也有可能是血管平滑肌細(xì)胞和血管外膜細(xì)胞分化而成[4]；④由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化[5]；⑤衰老的人成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，如表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的表達，其功能特性類似于CAFs，所以衰老的人成纖維細(xì)胞也可能是CAFs的前體細(xì)胞[2]。進一步通過倒置相差顯微鏡、透射電鏡及免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，CAFs的細(xì)胞呈紡錘形或長梭形，胞質(zhì)突少，細(xì)胞大小不一致，生長密集，排列方式較雜亂，無方向性，出現(xiàn)重疊生長，接觸和密度抑制喪失；胞核著色均勻，核仁明顯。胞質(zhì)內(nèi)見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體以及成束平行排列于胞膜下的肌絲，另見散在的電子致密斑，類似平滑肌的致密斑[4,6]。而一般正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblast, NF）呈多胞質(zhì)突的扁平星狀，細(xì)胞大小基本一致，排列有一定方向性；胞核形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基復(fù)合體發(fā)達，未見肌絲和致密斑；無重疊生長，具有接觸抑制和密度抑制特征。CAFs與正常成纖維細(xì)胞的表型明顯不同，α-SMA和I型膠原表達明顯增加，細(xì)胞增殖能力明顯增強，與永生化的上皮細(xì)胞共同注入裸鼠，其成瘤能力高于單獨接種上皮比較細(xì)胞500倍[7]。

1.2 CAFs的異質(zhì)性及其表型時、空轉(zhuǎn)換的含義 CAFs的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在其細(xì)胞表型不同，而其CAFs表型轉(zhuǎn)換具有時、空特性：一是時相性，即CAFs表型轉(zhuǎn)換與腫瘤發(fā)展階段密切相關(guān)；二是空間特性，一方面是指癌組織不同部位的成纖維細(xì)胞具有不同的表型，另一方面是同一成纖維細(xì)胞在組織內(nèi)不同部位呈現(xiàn)不同表型。研究發(fā)現(xiàn)由正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs時，其表型轉(zhuǎn)換與疾病演進過程密切相關(guān)。目前大家的共識是癌細(xì)胞與CAFs相互促進二者表型轉(zhuǎn)換，共同參與腫瘤演進過程，且CAFs具有異質(zhì)性[1,2]，但對成纖維細(xì)胞異質(zhì)性（表型變化的時、空特性）的原因尚不清楚。當(dāng)前研究的爭議有：①不同腫瘤中CAFs表型是否不同？②同一腫瘤CAFs與腫瘤細(xì)胞距離不同其表型也不同（空間特異性），其原因是癌細(xì)胞分泌相同細(xì)胞因子作用于不同亞型的成纖維細(xì)胞的結(jié)果，還是相同的成纖維細(xì)胞對癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子選擇性作用？③CAFs的表型轉(zhuǎn)換是不是腫瘤細(xì)胞隨時間“選擇” 的結(jié)果（時間特異性）。這些問題成為目前研究的熱點和難點，越來越多的研究提示CAFs表型轉(zhuǎn)換與腫瘤演進密切相關(guān)。

2 CAFs研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用中的問題

圖1 已發(fā)表的CAFs相關(guān)文章分析。A : CAFs與發(fā)表時間的關(guān)系；B：CAFs發(fā)表文章類型；C：CAFs發(fā)表雜志；D：CAFs與腫瘤種類。Fig 1 The analysis of related published articles on CAFs. A: The published article number on CAFs and time； B: The published article types on CAFs； C:The published article number on CAFs and journals； D: The published article number on CAFs and tumor types. CAFs: cancer-associated fibroblasts.

在Pubmed數(shù)據(jù)庫中分別以“Cancer-associated Fibroblasts”和“l(fā)ung cancer and Cancer-associated Fibroblasts”作為關(guān)鍵詞并限定在Title（標(biāo)題）中，截止到2012年2月29日，分別得到269篇和21篇研究文獻（圖1A）。對這些文章的發(fā)表時間（圖1B）及類型分析發(fā)現(xiàn)：①文章數(shù)量在2011年增加，占總數(shù)的40%（118/294），而且近5年（2007年1月-2012年1月）的數(shù)量占到90%（264/294），2007年以前發(fā)表的文章數(shù)量只占10%左右（30/294）；②基礎(chǔ)研究比例高達80%（224/294）（圖1C），臨床研究只有9.8%（29/294）；③從文章發(fā)表的雜志看（圖1D ）4種雜志發(fā)表數(shù)量占到所有雜志的38.77%（114/294），均是影響因子較高的雜志；④從CAFs與腫瘤類型看，目前的研究仍以乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌為主，肺癌只有21篇（8.4%）。結(jié)果提示：①CAFs的研究只是在最近1年-2年成為研究的熱點，且多集中在基礎(chǔ)研究；②研究集中于腺上皮來源的腺癌，肺癌的研究相對較少。上述文章研究結(jié)果的共識有：①CAFs與腫瘤細(xì)胞相互作用可加速腫瘤的演進過程；②CAFs表型的惡性轉(zhuǎn)換與腫瘤患者預(yù)后差呈正相關(guān)；③CAFs通過多種信號通路與腫瘤細(xì)胞進行交互對話，但機制不清；④不同器官的腫瘤組織中的癌成纖維細(xì)胞表型不同，α-SMA的表達水平在不同腫瘤的CAFs中表達水平不同，如前列腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的表達降低[8]。這些共識存在的問題有：①多數(shù)結(jié)論來自腫瘤細(xì)胞系的研究，結(jié)果難以應(yīng)用于臨床；②臨床研究也局限于腫瘤標(biāo)本，只有CAFs分子標(biāo)記物表達水平與臨床病理生理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，難以探討其相互作用機理。

3 CAFs與肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移

CAFs在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的募集、活化、增殖和血管芽的形成中扮演著關(guān)鍵角色。乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等組織的CAFs表達的Fox蛋白（Forkhead box F1,FoxF1）、小窩蛋白-1（Caveolae-1, Cav-1）與趨化因子及其受體均參與內(nèi)皮細(xì)胞活化和腫瘤血管新生過程。Fox蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一個轉(zhuǎn)錄因子家族，F(xiàn)oxf1在細(xì)胞增殖、分化和器官發(fā)育、塑型和功能形成中具有關(guān)鍵作用[9,10]。Foxf1在肺的間質(zhì)尤其是CAFs中大量表達[11]。Saito等[12]將肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞與Foxf1轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示CAFs增強了A549的增殖能力，且Foxf1轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞較普通成纖維細(xì)胞明顯提高了A549肺癌細(xì)胞株的侵襲能力。Cav-1基因被認(rèn)為是一個抑癌基因，在肺癌等多種惡性腫瘤中表達缺失，而癌細(xì)胞誘導(dǎo)CAFs中Cav-1基因表達缺失，進一步加速腫瘤生長與轉(zhuǎn)移[13]。

Wald等[14]研究發(fā)現(xiàn)CAFs表達CXCL12能夠明顯促進前列腺癌細(xì)胞L3、L4和肺癌A549細(xì)胞株的生長能力及克隆形成率，且A549能力最強；但不同種類的腫瘤CAFs表達的CXCL12影響能力不同。肺癌細(xì)胞表達趨化因子受體CXCR和CAFs表達的CXCL12與肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Muller等[15]也證實肺癌的常見轉(zhuǎn)移器官如骨、肝臟、腎上腺和腦中有高表達的CXCL12；CXCR4作為趨化因子CXCL12的受體，細(xì)胞膜高表達CXCR4的腫瘤比低表達的腫瘤更容易轉(zhuǎn)移[16]。CXCL12參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機制或與表達CXCL12的CAFs細(xì)胞參與了血管的生成有關(guān)[17]。

Twist1（胚胎以發(fā)育過程中高度保守的基因）的再次激活可通過EMT途徑促進腫瘤的發(fā)生與演進，且其在胃癌細(xì)胞和胃癌CAFs表達水平呈線性相關(guān)，提示CAFs的形成可能受腫瘤影響[18]。Twist表達上調(diào)可能引起肺泡上皮向腫瘤轉(zhuǎn)化，Twist表達水平與肺癌的分化程度密切相關(guān)，研究[18]發(fā)現(xiàn)CAFs細(xì)胞中Twist1表達水平明顯高于腫瘤細(xì)胞，提示CAFs與腫瘤細(xì)胞之間可能有協(xié)同效應(yīng)，表達Twist1的CAFs可以促進表達Twist1的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Pallier等[19]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中EGFR突變患者腫瘤細(xì)胞中Twist1基因表達升高，提示Twist1基因在肺癌細(xì)胞中的表達與EGFR的突變相關(guān)，并且與肺癌的惡性表型相關(guān)。

腎小球足突細(xì)胞粘蛋白（podoplanin）表達于毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮而不是血管內(nèi)皮，是目前較為公認(rèn)的腫瘤淋巴內(nèi)皮標(biāo)志物之一，已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達并與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hoshino等[20]研究112例人肺腺癌CAFs中Podoplanin表達，32例標(biāo)本CAFs中的Podoplanin表達陽性，且均有血管侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究[21,22]表明Cav-1的缺失也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而Cav-1的高水平表達可以減小腫瘤的轉(zhuǎn)移。

4 CAFs對肺癌的預(yù)后及治療的影響

肺癌的預(yù)后指標(biāo)一直是困繞臨床的難題，近來研究發(fā)現(xiàn)CAFs表型的惡性轉(zhuǎn)換與患者的預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤演進過程與CAFs和癌細(xì)胞細(xì)胞因子或基因表達水平呈正相關(guān)，且與肺癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，如Podoplanin[20]和碳酸酐酶IX，肺腺癌間質(zhì)纖維細(xì)胞中表達Podoplanin的患者預(yù)后較差并且容易早期復(fù)發(fā)[23]。Saito等[12]在研究中注意到，盡管表達Foxf1陽性的CAFs在所有人群中不能很明顯地表現(xiàn)出與預(yù)后的關(guān)系，但局限于女性人群和大細(xì)胞肺癌的患者生存率很差。細(xì)胞因子在癌細(xì)胞與相關(guān)成纖維細(xì)胞中的表達水平明顯不同（如趨化因子CXCL12/CXCR4表達陽性的癌細(xì)胞被表達陰性的CAFs包圍，反之亦然），但CXCL12/CXCR4在肺癌組織及CAFs的表達均促進了非小細(xì)胞肺癌的演進，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為肺癌的細(xì)胞膜表達的CXCR4可以作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后指標(biāo)。Cav-1基因表達降低或缺失與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[24]。在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的CAFs中大量表達Twist1基因的患者預(yù)后差，該結(jié)果與Sung等[18]研究的結(jié)果一致。

由于CAFs可促進腫瘤的形成、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，故將CAFs及其所產(chǎn)生的因子作為抗腫瘤治療藥物設(shè)計的靶點已成為可能。CAFs適合作為抗腫瘤治療新靶點的原因有：①CAFs是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其基因組較腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定，不會出現(xiàn)抗原丟失和治療耐受；②間質(zhì)成分通常占腫瘤組織質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%-90%，是豐富的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)；③CAFs通常靠近腫瘤間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞并圍繞癌巢；④間質(zhì)細(xì)胞在各種腫瘤中的差異較小，針對腫瘤間質(zhì)的抗腫瘤治療可用于多種實體腫瘤。肺CAFs的特殊作用為治療腫瘤提供了新的思路：①減弱或阻止傳入CAFs的促活化信號，減少其分泌的各種因子，從而阻止腫瘤微環(huán)境中的血管形成和腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Tejada等[25]發(fā)現(xiàn)由肺癌細(xì)胞分泌的血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）可以誘導(dǎo)肺癌間質(zhì)中的CAFs生長和增殖。而相關(guān)文獻[26]報道伊馬替尼是血小板源性生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor, PDGFR）的阻斷劑，Kinoshita等[27]研究發(fā)現(xiàn)伊馬替尼可以通過抑制CAFs中的PDGFR的絡(luò)氨酸激酶活性從而抑制CAFs自身的生長，間接抑制CAFs對腫瘤的作用。Haubeiss等[28]在其研究中發(fā)現(xiàn)達沙替尼可以更加高效地抑制CAFs上的PDGFR的激酶活性來抑制腫瘤的生長，其機制可能是達沙替尼聯(lián)合作用于PDGFR的不同激酶如Src激酶、TEC激酶、MAP激酶等[29]；②減弱或阻斷由CAFs產(chǎn)生的各種因子或者蛋白的作用，Cheng等[30]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用成纖維細(xì)胞活化蛋白多克隆抗體處理人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29異種移植瘤后腫瘤生長減慢。目前各種生長因子、細(xì)胞因子抑制劑正投入臨床各期試驗中；③以CAFs為靶標(biāo)促進腫瘤CAFs的死亡或凋亡。誘導(dǎo)CAFs程序性死亡也是抗腫瘤間質(zhì)治療的策略之一。目前，已設(shè)計出的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽觸發(fā)依賴半胱氨酸天冬酰胺特異蛋白酶的程序性死亡途徑，降低了CAFs的生存率。另外，Pietras等[31,32]發(fā)現(xiàn)實體瘤間質(zhì)液壓（interstitial fl uid pressure,IFP）升高可妨礙抗腫瘤藥物的有效運輸，CAFs可通過PDGF調(diào)節(jié)IFP。體內(nèi)動物研究證實PDGF受體拮抗劑可有效降低IFP，提高化療藥物的治療效果。

5 展望

CAFs是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞相比其基因組較為穩(wěn)定，因此破壞CAFs的生長或干擾其功能后，可通過阻礙新生血管形成而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲。CAFs的異常增殖能力對上皮細(xì)胞的間質(zhì)化等生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，從而營造有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的腫瘤微環(huán)境。因此， CAFs惡性表型轉(zhuǎn)換所需要的表達水平變化的Foxf1轉(zhuǎn)錄因子、TWIST-1基因、CXCR/CXCR4軸以及Podoplanin等都將成為腫瘤基因治療或免疫治療的新靶點，這種針對腫瘤微環(huán)境的治療也將會成為肺癌防治的新途徑。