丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞腸道菌群、形態(tài)結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的影響

劉亭婷 滑 靜 王曉霞 劉莉如 海 鵬

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，北京 102206;3.北京市昌平區(qū)區(qū)委，北京 102200;4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052;5.遼寧阜新市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，阜新 123000)

隨著畜牧業(yè)現(xiàn)代化的實(shí)現(xiàn)，健康養(yǎng)殖理念越來(lái)越多地受到關(guān)注，而健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵就是腸道健康。長(zhǎng)期以來(lái)，由于抗生素的添加使得畜禽維持短期的健康狀態(tài)，而這種健康是一種偽健康，不僅導(dǎo)致畜禽腸道有益菌被抑制，菌群平衡被破壞，而且畜禽經(jīng)常反復(fù)接觸某種抗生素后會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生抗藥性。當(dāng)飼料中禁止添加抗生素時(shí)，如何維持或增強(qiáng)畜禽健康就成為目前研究的重點(diǎn)，尤其是畜禽早期的腸道健康。腸道健康是一門(mén)復(fù)雜的學(xué)科，涉及腸道微生物區(qū)系的平衡、宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的完整性和免疫系統(tǒng)的狀態(tài)等。丁酸梭菌是普遍存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一種益生菌，已有研究表明丁酸梭菌可以促進(jìn)腸道有益菌群增殖，丁酸梭菌代謝可以產(chǎn)生丁酸，抑制腸道有害菌生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)刺激黏膜免疫;丁酸梭菌還可以產(chǎn)生B族維生素、維生素K、葉酸和多種酶類物質(zhì)等，對(duì)機(jī)體有重要的生理功能。目前，對(duì)該菌的研究主要集中在腹瀉、炎癥性腸病的防治與預(yù)防上，在動(dòng)物尤其在蛋用仔公雞生產(chǎn)上應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)在飼糧中添加丁酸梭菌，通過(guò)測(cè)定蛋用仔公雞腸道菌群、小腸黏膜結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞分布等來(lái)探討不同丁酸梭菌水平對(duì)蛋用仔公雞腸道健康的影響，為其在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌(批次號(hào):S20110309)由浙江惠嘉生物科技有限公司提供，其中活菌數(shù)≥1.0×108CFU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，選用1日齡健康海蘭褐蛋用仔公雞240只，平均體重在(39.36 ±0.11)g，隨機(jī)分成 6 組，每組 4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加150 mg/kg金霉素，試驗(yàn)組飼糧分別在基礎(chǔ)飼糧中添加 250、500、750、1 000 mg/kg丁酸梭菌。試驗(yàn)期為42d。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，按常規(guī)免疫程序免疫，定期清理打掃雞舍衛(wèi)生并消毒?；A(chǔ)飼糧是根據(jù)美國(guó)NRC(1994)推薦的營(yíng)養(yǎng)需要配制的玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用3層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，光照、溫度和濕度嚴(yán)格按照常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行，按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，并定期清掃雞舍和消毒保持雞舍清潔衛(wèi)生。試驗(yàn)期為42d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 腸道菌群

試驗(yàn)雞于試驗(yàn)的第42天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取1只體重接近平均體重、健康狀況較好的蛋用仔公雞屠宰，無(wú)菌條件下取盲腸腸段用棉線將其兩端結(jié)扎，紗布包好，于－80℃速凍以備大腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的測(cè)定，結(jié)果用1 g腸道內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)量的對(duì)數(shù)［lg(CFU/g)］表示。

1.4.2 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)

于試驗(yàn)的第42天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取1只體重接近平均體重、健康狀況較好的蛋用仔公雞屠宰，切取十二指腸、空腸和回腸中段各2 cm組織樣，生理鹽水沖洗干凈，分別置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)和戊二醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)中，固定48 h。其中多聚甲醛固定的部分腸段常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋、切片厚5 μm、蘇木精－伊紅(HE)染色。應(yīng)用BX51病理圖像分析處理系統(tǒng)，每個(gè)腸段取5張不連續(xù)切片，每張切片選取5個(gè)最長(zhǎng)腸絨毛測(cè)量絨毛的高度、相鄰絨毛的隱窩深度及相應(yīng)黏膜厚度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值，各指標(biāo)取平均值作為測(cè)定數(shù)據(jù)。戊二醛緩沖液固定的腸段用來(lái)做掃描電鏡切片，掃描電鏡觀測(cè)腸黏膜表面腸絨毛的變化情況。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(air-dry basis) %

1.4.3 小腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量分布

1.4.3.1 上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞

石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色后，光鏡下可觀察上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞形態(tài)分布。小腸各腸段分別取5張切片，每張切片選取5個(gè)最長(zhǎng)腸絨毛，統(tǒng)計(jì)腸絨毛相同部位單位(相同)面積視野內(nèi)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

1.4.3.2 杯狀細(xì)胞

部分十二指腸、空腸和回腸的切片進(jìn)行糖原及多糖高碘酸－Schiff氏液(PAS)染色，可顯示小腸上皮杯狀細(xì)胞。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察，每個(gè)腸段取5張切片，每張切片選取5個(gè)最長(zhǎng)腸絨毛，統(tǒng)計(jì)單個(gè)絨毛相同部位單位面積視野內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)量及變化，各指標(biāo)取平均值作為測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.4.3.3 免疫球蛋白A(IgA)陽(yáng)性物質(zhì)

小腸的切片按常規(guī)免疫組織化學(xué)抗生蛋白鏈菌素生物素復(fù)合體法(SABC)染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2封閉內(nèi)源性酶10 min和5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫下作用20 min后，滴加羊抗雞 IgA 單抗(1∶500倍稀釋)，4℃過(guò)夜;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加生物素標(biāo)記兔抗羊免疫球蛋白G(IgG)二抗，室溫下20 min;PBS洗滌后，滴加鏈霉親和素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物試劑，37℃ 20 min，增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照組染色用PBS代替一抗。光鏡下觀察IgA陽(yáng)性物質(zhì)的數(shù)量及分布，并應(yīng)用BX51病理圖像分析處理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)小腸黏膜單位面積內(nèi)IgA陽(yáng)性物質(zhì)的有效數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel進(jìn)行初步處理，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組間相關(guān)指標(biāo)的差異，采用最小顯著級(jí)差法對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)蛋用仔公雞盲腸中幾項(xiàng)微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。由此可以看出，42日齡時(shí)，各試驗(yàn)組蛋用仔公雞的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)均小于對(duì)照組，其中750 mg/kg丁酸梭菌組與1 000 mg/kg丁酸梭菌組的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)與對(duì)照組和抗生素組相比顯著降低(P＜0.05)，分別比對(duì)照組降低了11.70%、14.01%，分別比抗生素組降低了 9.23%、11.61%。42日齡時(shí)，除250 mg/kg丁酸梭菌組外，其他各試驗(yàn)組盲腸內(nèi)乳桿菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P＜0.05)，其中1 000 mg/kg丁酸梭菌組的盲腸內(nèi)乳桿菌數(shù)量最高，分別比對(duì)照組和抗生素組增加了6.05%、2.15%。42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組盲腸內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量隨丁酸梭菌添加量的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)。

表2 丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞盲腸菌群的影響Table 2 Effects of Clostridium butyricum on cecal flora of egg-laying male chicks lg(CFU/g)

2.2 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2.1 小腸黏膜的光鏡觀察

經(jīng)HE染色后，各組動(dòng)物小腸腸壁層次分明，對(duì)照組的黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，偶見(jiàn)腸絨毛頂端脫落現(xiàn)象，有的絨毛較細(xì)，排列不緊密。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組和抗生素組蛋用仔公雞腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，層次分明，腸黏膜上皮表面的紋狀緣結(jié)構(gòu)清晰，腸絨毛排列較緊密。各組的小腸黏膜上皮細(xì)胞輪廓清晰，排列緊密，染色鮮明。柱狀細(xì)胞呈高柱狀，單層排列，胞漿豐富，胞核橢圓形，位于細(xì)胞基部。杯狀細(xì)胞呈現(xiàn)高腳狀，分散在柱狀細(xì)胞之間，染色鮮明(圖1)。

2.2.2 小腸黏膜的掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察顯示，對(duì)照組的小腸黏膜表面腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，但腸絨毛排列不整齊，絨毛之間間距大，絨毛呈葉片狀，絨毛頂端橢圓形，表面有長(zhǎng)短不一、縱橫交錯(cuò)的溝痕。而各試驗(yàn)組的腸絨毛排列較整齊，與對(duì)照組相比較寬厚，腸絨毛密度大、間距較小，表面溝痕大部分與腸絨毛縱軸近似垂直，溝痕多且更加明顯，微絨毛紋狀緣排列緊密(圖2)。

圖1 對(duì)照組與1 000 mg/kg丁酸梭菌組空腸的黏膜結(jié)構(gòu)Fig.1 Jejunum mucosal structure of control group and 1 000 mg/kg Clostridium butyricum group

圖2 1000 mg/kg丁酸梭菌組雞空腸黏膜絨毛形狀與對(duì)照組比較Fig.2 Comparison of mucosal villus shape of 1 000 mg/kg Clostridium butyricum group with that of control group

2.3 丁酸梭菌對(duì)小腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響

2.3.1 丁酸梭菌對(duì)十二指腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響

表3顯示丁酸梭菌對(duì)十二指腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響，從表中可以看出，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000mg/kg丁酸梭菌組十二指腸的絨毛高度顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P＜0.05)，其中以750 mg/kg丁酸梭菌組最高，比對(duì)照組高了26.00%，比抗生素組高了7.86%，其次是1 000 mg/kg丁酸梭菌組，這2個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。6個(gè)組中，V/C值最大的是1 000 mg/kg丁酸梭菌組，與除750 mg/kg丁酸梭菌組外的其他各組差異顯著(P＜0.05);250 mg/kg丁酸梭菌組和500 mg/kg丁酸梭菌組V/C值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但與抗生素組相比差異不顯著(P＞0.05)，這2組之間差異也不顯著(P＞0.05)。對(duì)照組的黏膜厚度的值最小，但僅與1 000mg/kg丁酸梭菌組相比差異顯著(P＜0.05)，其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。各組肌層厚度之間差異不顯著(P＞0.05)，但試驗(yàn)組隨丁酸梭菌添加量的增加，基層厚度增加。

表3 丁酸梭菌對(duì)蛋用肉仔公雞十二指腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響Table 3 Effects of Clostridium butyricum on villus height，V/C value and thickness of mucosa and muscular layer ofduodenum of egg-laying male chicks

2.3.2 丁酸梭菌對(duì)空腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響

表4顯示丁酸梭菌對(duì)空腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響，從表中可以看出，各試驗(yàn)組與抗生素組的空腸絨毛高度與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組與抗生素組相比差異顯著(P ＜0.05)，分別比抗生素組高了 11.97%、15.82%，這 2 組之間差異不顯著(P ＞0.05)。750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組的V/C值與對(duì)照組相比顯著增大(P＜0.05)，與抗生素組相比差異不顯著(P＞0.05)，除250 mg/kg丁酸梭菌組外，其他各試驗(yàn)組之間V/C值差異不顯著(P＞0.05)。各試驗(yàn)組的黏膜厚度均比對(duì)照組顯著增厚(P＜0.05)，其中黏膜厚度最大的是1 000mg/kg丁酸梭菌組，比對(duì)照組增加了27.90%。除250 mg/kg丁酸梭菌組外，其他各試驗(yàn)組與抗生素組相比黏膜厚度也顯著增加(P＜0.05)。對(duì)于肌層厚度，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表4 丁酸梭菌對(duì)蛋用肉仔公雞空腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響Table 4 Effects of Clostridium butyricum on villus height，V/C value and thickness of mucosa and muscular layer of jejunum of egg-laying male chicks

2.3.3 丁酸梭菌對(duì)回腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響

表5顯示丁酸梭菌對(duì)回腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響，從表中可以看出，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組絨毛高度與對(duì)照組相比差異顯著，分別比對(duì)照組高了21.10%、20.79%(P ＜0.05);各試驗(yàn)組與抗生素組相比差異不顯著(P＞0.05)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。對(duì)于V/C值的比較，僅1 000 mg/kg丁酸梭菌組與對(duì)照組和抗生素組差異顯著(P＜0.05)，分別比對(duì)照組和抗生素組增加了40.43%和 33.12%;除 1 000 mg/kg丁酸梭菌組外，其他各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，500 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組的黏膜厚度顯著增加(P＜0.05);各試驗(yàn)組與抗生素組相比差異不顯著(P＞0.05)，各試驗(yàn)組之間差異也不顯著(P＞0.05)。各組肌層厚度沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但隨丁酸梭菌添加量的增加有增厚的趨勢(shì)。

表5 丁酸梭菌對(duì)蛋用肉仔公雞回腸絨毛高度、V/C值、黏膜厚度和肌層厚度的影響Table 5 Effects of Clostridium butyricum on villus height，V/C value and thickness of mucosa and muscular layer of ileum of egg-laying male chicks

2.4 黏膜免疫

2.4.1 丁酸梭菌對(duì)小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量及分布的影響

經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分散在小腸絨毛的上皮細(xì)胞之間，多位于上皮細(xì)胞基側(cè)膜附近，少數(shù)位于上皮核層和頂層，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以小型細(xì)胞為主，胞核大且呈圓形，深染，胞漿少。固有層內(nèi)也有淋巴細(xì)胞分布。

圖3 1000 mg/kg丁酸梭菌組空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞Fig.3 Intraepithelial lymphocyte in jejunum of 1 000 mg/kg Clostridium butyricum group

丁酸梭菌對(duì)小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響見(jiàn)表6，各組十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量差異不顯著(P＞0.05)。750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)，分別比對(duì)照組增加了24.05%、25.32%，與抗生素組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，各試驗(yàn)組之間也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。試驗(yàn)組中，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)，分別比對(duì)照組增加了15.28%、15.44%，與抗生素組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，各試驗(yàn)組之間也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。從表中還可看出，不同的腸段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量也有所不同，各組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量由十二指腸向回腸逐漸減少。

2.4.2 丁酸梭菌對(duì)小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量及分布的影響

經(jīng)PAS染色后，杯狀細(xì)胞散在分布于上皮細(xì)胞間，高腳杯狀，頂部胞質(zhì)為大量糖原顆粒擁塞而膨隆，底部纖細(xì)，有小而深染的不規(guī)則核與少量嗜堿性胞質(zhì)。PAS染色呈桃紅色陽(yáng)性反應(yīng)。

表6 丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞小腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的影響Table 6 Effects of Clostridium butyricum on the change of intraepithelial lymphocyte number in small intestine of egg-laying male chicks

圖4 1 000 mg/kg丁酸梭菌組空腸杯狀細(xì)胞Fig.4 Goblet cells in jejunum of 1 000 mg/kg Clostridium butyricum group

由表7可知，同一腸段但不同組間杯狀細(xì)胞數(shù)量分布有差異，試驗(yàn)組中，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組十二指腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)，均比對(duì)照組增加了45.90%，與抗生素組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。各試驗(yàn)組中，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)量最多，均比250 mg/kg丁酸梭菌組顯著增加(P＜0.05)，但這 2組之間差異不顯著(P＞0.05)。各試驗(yàn)組中僅1 000 mg/kg丁酸梭菌組空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P＜0.05)，分別比對(duì)照組和抗生素組高了30.61%、24.27%。750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組回腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)，分別比對(duì)照組高了33.64%、39.09%。1 000 mg/kg丁酸梭菌組回腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量與抗生素組相比顯著增加(P＜0.05)，同時(shí)也顯著高于250 mg/kg丁酸梭菌組(P＜0.05)，除1 000 mg/kg丁酸梭菌組外，其他各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。不同的腸段杯狀細(xì)胞的數(shù)量也有所不同，各組杯狀細(xì)胞數(shù)量由十二指腸向回腸逐漸增多。

2.4.3 丁酸梭菌對(duì)小腸黏膜IgA陽(yáng)性物質(zhì)有效數(shù)量及分布的影響

免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果表明，IgA漿細(xì)胞分散于小腸絨毛固有層、腸腺周?chē)?，IgA漿細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)，為深棕色，細(xì)胞核呈陰性反應(yīng)。IgA漿細(xì)胞向腸腔分泌的陽(yáng)性反應(yīng)物分布于絨毛表面和固有層，免疫組織化學(xué)染色后也呈陽(yáng)性反應(yīng)，因此該試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的是IgA漿細(xì)胞和IgA的陽(yáng)性反應(yīng)物。

表7 丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞小腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量變化的影響Table 7 Effects of Clostridium butyricum on the change of goblet cell number in small intestine of egg-laying male chicks

圖5 對(duì)照組與1 000 mg/kg丁酸梭菌組空腸黏膜IgA陽(yáng)性物質(zhì)Fig.5 IgA positive material in jejunum of control group and 1 000 mg/kg Clostridium butyricum group

由表8可以看出，1 000 mg/kg丁酸梭菌組的十二指腸IgA陽(yáng)性物質(zhì)有效數(shù)量最多，達(dá)到66.75個(gè)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但與抗生素組相比差異不顯著(P＞0.05)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。500 mg/kg丁酸梭菌組、750 mg/kg丁酸梭菌組、1000 mg/kg丁酸梭菌組空腸的IgA陽(yáng)性物質(zhì)有效數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，分 別 比 對(duì) 照 組 高 了 18.84%、18.84%、21.26%，但與抗生素組相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，4個(gè)試驗(yàn)組之間的差異也不顯著(P＞0.05)。各組回腸IgA陽(yáng)性物質(zhì)有效數(shù)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，僅隨丁酸梭菌添加量升高呈增加趨勢(shì)。

表8 丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞小腸黏膜IgA陽(yáng)性物質(zhì)有效數(shù)量及分布的影響Table 8 Effects of Clostridium butyricum on the number anddistribution of IgA positive material in small intestine of egg-laying male chicks 個(gè)

3 討論

3.1 腸道菌群

動(dòng)物的腸道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道內(nèi)的微生物對(duì)于動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)、免疫、生理功能的發(fā)揮以及疾病防治等都發(fā)揮著重要的影響。據(jù)報(bào)道，腸道占優(yōu)勢(shì)的菌群為雙歧桿菌、乳酸桿菌及擬桿菌，其次為消化球菌及彎曲桿菌等厭氧菌。腸道中，盲腸內(nèi)細(xì)菌的種類豐富和數(shù)量多，且以厭氧菌為主，總菌數(shù)達(dá)1011個(gè)/g。雖然目前對(duì)雞盲腸微生物微生態(tài)學(xué)的研究遠(yuǎn)沒(méi)有反芻動(dòng)物瘤胃和豬后腸微生物微生態(tài)學(xué)的研究深入，但是研究雞盲腸內(nèi)容物中微生物的正常腸道菌群變化，對(duì)防治腸道感染疾病具有很高的實(shí)用價(jià)值［1－2］。

唐寶英等［3］在雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌和糞鏈球菌的培養(yǎng)基中加入相同比例的丁酸梭菌發(fā)酵提取物，室溫培養(yǎng)24 h，結(jié)果表明3種菌的活菌含量分別比對(duì)照組提高了 24.00%、42.57%和6.76%，這說(shuō)明丁酸梭菌能夠促進(jìn)有益菌的增殖。體內(nèi)試驗(yàn)也有相同的研究結(jié)果，趙熙等［4］通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)對(duì)丁酸梭菌活菌制劑對(duì)腸道菌群的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，受試對(duì)象腸道內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量極顯著增加，乳酸桿菌數(shù)量顯著增加，說(shuō)明丁酸梭菌活菌制劑具有一定的增殖腸道內(nèi)有益菌和抑制有害菌的作用。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致，可以表明丁酸梭菌可以促進(jìn)有益菌增殖并抑制有害菌生長(zhǎng)從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。究其原因可能是丁酸梭菌代謝可產(chǎn)生淀粉酶，淀粉酶水解淀粉和碳水化合物生成的低聚糖更容易被雙歧桿菌和乳酸菌所利用，而且丁酸梭菌生長(zhǎng)速度快，能夠產(chǎn)生大量丁酸、乳酸等有機(jī)酸，使腸道pH降低，不利于有害菌生長(zhǎng)。

3.2 小腸黏膜結(jié)構(gòu)

腸道是機(jī)體消化、吸收的重要的場(chǎng)所，一個(gè)保持完整性的健康腸道可以確保有價(jià)值的飼料營(yíng)養(yǎng)成分得到完全的消化和吸收。小腸的正常結(jié)構(gòu)尤其是絨毛高度、隱窩深度及V/C值等是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。腸絨毛作為小腸的重要組成部分，在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)上尤為重要，其強(qiáng)有力的、有規(guī)律的擺動(dòng)還可以排斥有害菌群的定植。而且，指狀腸絨毛形態(tài)與腸上皮細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)，當(dāng)絨毛變高變寬時(shí)，腸上皮細(xì)胞數(shù)量增多，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸和吸收面積增大，對(duì)養(yǎng)分的吸收能力增強(qiáng)，反之，絨毛短、窄，吸收面積則小，對(duì)養(yǎng)分的吸收能力降低。隱窩是絨毛基部的上皮下陷至固有層形成的管狀結(jié)構(gòu)，它的深度反映了細(xì)胞生產(chǎn)率，細(xì)胞從隱窩基部不斷向絨毛頂部遷移、分化，形成有吸收能力的細(xì)胞，從而補(bǔ)充絨毛上皮的正常脫落。當(dāng)這一過(guò)程減慢時(shí)，隱窩基部的細(xì)胞生成率降低，隱窩變淺，說(shuō)明腸上皮細(xì)胞的成熟率上升，吸收能力增強(qiáng)。如果隱窩變深則說(shuō)明機(jī)體的組織代謝增快，維持需要增加，生產(chǎn)性能降低。所以，V/C值可以很好地反映小腸的功能情況，比值上升，黏膜改善，消化吸收能力增強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育快;比值下降，可能黏膜受損，消化吸收能力降低［5－7］。而黏膜的厚薄與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程有關(guān)，進(jìn)而影響小腸的吸收的功能。

相關(guān)的研究表明［8］，丁酸梭菌對(duì)于斷奶仔豬的小腸形態(tài)有明顯的改善功能，斷奶第7天，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌可以顯著增加回腸絨毛高度。當(dāng)丁酸梭菌與谷氨酰胺連用時(shí)，斷奶第7、14天，與對(duì)照組相比，復(fù)合組的十二指腸絨毛高度有顯著地提高，隱窩深度顯著變淺。在本試驗(yàn)的研究中，也有相一致的結(jié)果，1 000 mg/kg丁酸梭菌組的添加效果較為理想，能夠使各個(gè)腸段的絨毛高度、V/C值、黏膜厚度都顯著高于對(duì)照組，1 000 mg/kg丁酸梭菌組與對(duì)照組相比，使十二指腸的絨毛高度增加了22.77%，V/C值增加了55.50%，黏膜厚度增加了19.98%;空腸絨毛高度增加24.47%，V/C值增加35.34%，黏膜厚度增加27.90%;回腸的絨毛高度增加了20.79%，V/C值增加了40.43%，黏膜厚度增加了20.33%。這說(shuō)明丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞的小腸形態(tài)具有改善作用，增強(qiáng)了消化吸收功能，可以促進(jìn)蛋用仔公雞的生產(chǎn)發(fā)育。丁酸梭菌產(chǎn)生這一效果的原因，可能是丁酸梭菌的主要代謝產(chǎn)物為丁酸，丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)腸道上皮組織的再生和修復(fù)有重要作用。

3.3 黏膜免疫

腸道不僅是消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，還是機(jī)體最大的免疫器官，發(fā)揮重要的免疫功能，腸道黏膜就是抵御病原微生物進(jìn)入體內(nèi)、防止機(jī)體感染的第一道屏障，包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障、免疫學(xué)屏障和腸黏膜固有層篩等部分［9－11］。其中，腸黏膜機(jī)械屏障和免疫學(xué)屏障具有重要的作用。腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性與腸黏膜機(jī)械屏障功能密切相關(guān)，免疫學(xué)屏障則主要由免疫球蛋白、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等共同構(gòu)成，而免疫細(xì)胞又包括淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞位于腸絨毛上皮細(xì)胞之間，在黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原，它不僅參與免疫反應(yīng)，還能通過(guò)偽足與上皮細(xì)胞接觸，加速上皮細(xì)胞的再生，在腸道黏膜中起著重要的免疫作用［12］。

楊慧［13］以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究益生菌對(duì)其黏膜結(jié)構(gòu)和黏膜免疫的影響，結(jié)果表明，益生菌可以增加小鼠腸道內(nèi)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)還有報(bào)道，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加可能代表機(jī)體黏膜免疫力的增強(qiáng)［14］。在本試驗(yàn)研究中，750 mg/kg丁酸梭菌組和1 000 mg/kg丁酸梭菌組對(duì)小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響較明顯，這2個(gè)試驗(yàn)組空腸和回腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組高了 20.05%、25.32%。這與楊慧［13］的試驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明丁酸梭菌可以顯著提高蛋用仔公雞小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)腸黏膜免疫水平。本試驗(yàn)還可以看出，從十二指腸到回腸，小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，這一分布規(guī)律與相關(guān)報(bào)道相一致［15－16］。

小腸絨毛上的杯狀細(xì)胞是一種典型的糖蛋白分泌細(xì)胞，分泌的黏蛋白釋入管腔內(nèi)成為潤(rùn)滑性黏液覆蓋在小腸黏膜表面，形成接觸外部環(huán)境的屏障，對(duì)上皮有保護(hù)作用［17］。黏液層如同分子篩，選擇性的排斥大分子物質(zhì)，氨基酸等小分子物質(zhì)則可以自由通過(guò)，同時(shí)黏液能夠保護(hù)上皮表面不受細(xì)菌、病毒及水解酶的侵害。但黏液的黏性要保持一定的平衡，如果平衡破壞，將影響小腸的正常生理功能。而且，杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白與柱狀細(xì)胞分泌的復(fù)合糖蛋白組成腸道黏膜上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞衣，細(xì)胞衣的糖蛋白和細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)可以結(jié)合牢固，捕獲微生物，是潛在致病原的重要物理屏障。此外有研究表明杯狀細(xì)胞可能在腸黏膜損傷后的重建過(guò)程中起關(guān)鍵作用［18－19］。

在本試驗(yàn)研究中，1 000 mg/kg丁酸梭菌組飼喂效果明顯，十二指腸、空腸、回腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組高了45.90% 、30.61%、39.09%。1 000 mg/kg 丁酸梭菌組空腸、回腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量還顯著高于抗生素組，分別比抗生素組提高了24.27%、22.40%。這說(shuō)明丁酸梭菌可以顯著提高蛋用仔公雞小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量，更好的發(fā)揮免疫屏障作用，保護(hù)機(jī)體免受外界病原微生物的侵害。

在腸道黏膜免疫系統(tǒng)起著中心作用的是分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，在腸道分泌物中含量豐富，漿細(xì)胞分泌的IgA經(jīng)過(guò)腸上皮細(xì)胞或在細(xì)胞間隙內(nèi)與上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌片段結(jié)合形成sI-gA，它參與體液免疫，可以防止病原微生物的入侵，同時(shí)在調(diào)節(jié)腸道菌群方面也發(fā)揮著重要作用［20］。有研究表明，機(jī)體sIgA有調(diào)節(jié)多層黏膜防御體系的能力，第1層在腸腔，通過(guò)sIgA排除抗原;第2層在上皮細(xì)胞內(nèi)，清除細(xì)胞內(nèi)病原體等;第3層在黏膜固有層，sIgA通過(guò)分泌途徑排出抗原到腸腔［21］。

本試驗(yàn)表明，蛋用仔公雞飼喂不同水平的丁酸梭菌與對(duì)照組相比，都可以使小腸黏膜中IgA陽(yáng)性物質(zhì)的有效數(shù)量有一定地增加，在十二指腸中，1 000 mg/kg丁酸梭菌組比對(duì)照組顯著高了17.11%，空腸中 750 mg/kg丁酸梭菌組與1 000 mg/kg丁酸梭菌組也顯著高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組提高18.84%、21.26%。回腸中，各組之間差異不顯著，但隨丁酸梭菌添加量的增加IgA陽(yáng)性物質(zhì)的有效數(shù)量呈增加趨勢(shì)。綜上可知，丁酸梭菌可以增強(qiáng)腸道黏膜的抵抗力，提高機(jī)體免疫力，添加量以1 000 mg/kg為佳。

4 結(jié)論

①丁酸梭菌能夠增加乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量，1 000 mg/kg丁酸梭菌組調(diào)節(jié)菌群的效果好于其他組。這說(shuō)明，丁酸梭菌可以促進(jìn)有益菌增殖并抑制有害菌生長(zhǎng)從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。

②飼糧中添加丁酸梭菌能顯著改善蛋用仔公雞小腸黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，黏膜厚度、絨毛高度、V/C值等相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)也增加了黏膜上皮淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及IgA陽(yáng)性物質(zhì)的數(shù)量。且1 000 mg/kg丁酸梭菌組的效果好于其他組，增強(qiáng)了消化吸收能力，從而維護(hù)了腸道正常的黏膜屏障功能，提高了免疫水平。

③綜上可知，丁酸梭菌能夠促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，維持腸道健康，在本試驗(yàn)條件下，最適宜的添加水平為1 000 mg/kg。

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