紅豆杉屬植物的引種及產(chǎn)物累積研究

肖臘興，李志良，，葉岸青，羅萬(wàn)業(yè)，黃巧明，丁文恩

(1.廣東省梅州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 梅州 514011;2.廣東省梅州市中大南藥發(fā)展有限公司，廣東 梅州 514011)

1 引言

紅豆杉屬植物是國(guó)家一級(jí)保護(hù)樹種，其根皮和枝葉中含有的化學(xué)成分紫杉醇是具有良好活性的抗癌藥［1］，對(duì)卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌有明顯療效。紅豆杉在自然條件下生長(zhǎng)緩慢，枝葉中產(chǎn)物含量低，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，天然資源受到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)資源緊缺狀況。

紅豆杉在全世界共有11種，目前我國(guó)天然分布的共有4種和1變種，分別是中國(guó)紅豆杉(Taxus chinensis(pilger)Rehd.)、云南紅豆杉(T.yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、東北紅豆杉(T.cuspidata Sieb.et zucc.)、西藏紅豆杉(T.wallichiana Zucc.)和南方紅豆杉(T.chinensis(Pilger)Rehd.Var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu)。曼地亞紅豆杉(T.media)是20世紀(jì)90年代中期從加拿大引進(jìn)的東北紅豆杉與歐洲紅豆杉的雜交種［2］，在我國(guó)四川、山東等地有種植。

廣東地處熱帶、南亞熱帶氣候區(qū)，全境僅在粵北的韶關(guān)、清遠(yuǎn)等市有天然紅豆杉的零星分布?；葜菔辛挚扑葐挝婚_展了南方紅豆杉與云南紅豆杉的引種研究［3］。1997年開始，研究單位陸續(xù)從西南、東北、華南部分省份引進(jìn)上述各種紅豆杉植物到梅州山區(qū)開展種植試驗(yàn)，研究其生殖、生長(zhǎng)、病蟲害、產(chǎn)物累積等規(guī)律［4，5］。

試驗(yàn)地位于廣東省東北部的梅州市境內(nèi)各縣山區(qū)，地處東經(jīng) 115°18'～ 116°56'，北緯 23°23'～ 24°56'，氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，是南亞熱帶和中亞熱帶氣候區(qū)的過(guò)渡地帶［6］。其氣候特點(diǎn)是夏日長(zhǎng)、冬日短、冷熱懸殊、光照充足、氣流閉塞、雨水充沛，年均氣溫21.3℃，年降水量1400～1800mm。試驗(yàn)地土壤多為黃壤、紅壤，土質(zhì)疏松，肥力一般。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用中國(guó)紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉由中科院武漢植物研究所聯(lián)系提供，云南紅豆杉由梅縣林業(yè)局聯(lián)系提供，南方紅豆杉由福建省明溪縣綠色生態(tài)研究所提供，曼地亞紅豆杉由梅縣梅雁生物工程研究所提供。紅豆杉苗木規(guī)格為高40～60cm，地徑0.5～0.8cm，其中曼地亞紅豆杉及云南紅豆杉為扦插苗，其余苗木為實(shí)生苗。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 種植撫育

研究單位從1997年始開展紅豆杉的引種研究，分別選擇不同海拔高度地點(diǎn)、不同遮光條件進(jìn)行種植。紅豆杉栽種前，全面劈除林地雜草和灌木，帶狀整地，行距為1～2m，帶寬約1m，帶中挖穴，種植時(shí)間為當(dāng)年11月底到次年3月，選擇陰雨天氣，林地土壤濕潤(rùn)時(shí)進(jìn)行栽種。每年撫育1～2次，撫育以全面劈草為主，結(jié)合松土和擴(kuò)帶培土，根據(jù)林齡大小，每株施以農(nóng)家肥料或復(fù)合肥1～2kg。

2.2.2 生長(zhǎng)情況記錄

紅豆杉種植后，定期記錄紅豆杉生長(zhǎng)情況，包括顏色、長(zhǎng)勢(shì)、高度、冠幅、苗木保存率及開花結(jié)實(shí)情況。

2.2.3 枝葉樣品處理

定期采收紅豆杉枝葉進(jìn)行紫杉醇含量分析，紅豆杉枝葉于烘箱中55℃條件下干燥至恒重后粉碎。精密稱取紅豆杉枝葉干粉3g，加入丙酮－水(3∶2)50mL浸提，并用磁力攪拌器攪拌60min后過(guò)濾，重復(fù)操作4次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收丙酮。剩余的液體置分液漏斗中，加入50mL二氯甲烷萃取，共3次，收集二氯甲烷相并減壓濃縮至干，殘留物用乙醇溶解定容至25mL，搖勻后取1mL定容至10mL，用0.45μm 濾膜過(guò)濾，濾液供HPLC檢測(cè)。

2.2.4 紫杉醇含量的檢測(cè)

樣品的檢測(cè)采用Waters HPLC系統(tǒng)，色譜條件為:Nova－Pak C18(3.9×150 mm)色譜柱;流動(dòng)相是V甲醇∶V乙腈∶V水=29∶27∶44;柱溫 35 ℃;流速 1.0 mL·min;檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm;靈敏度0.05 Aufs，標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SIGMA公司。

3 結(jié)果與分析

3.1 生長(zhǎng)適應(yīng)性及枝葉中紫杉醇產(chǎn)物的累積分析

根據(jù)多年來(lái)對(duì)種植的各種紅豆杉的跟蹤記錄，結(jié)合產(chǎn)物含量檢測(cè)結(jié)果，匯總整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明:東北紅豆杉在本地不能正常生長(zhǎng);曼地亞紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，每年的生長(zhǎng)期較短;其余各種紅豆杉均能正常生長(zhǎng)、繁殖;曼地亞紅豆杉及云南紅豆杉枝葉中產(chǎn)物含量較高。各種紅豆杉均未出現(xiàn)明顯病蟲害［3］。

表1 紅豆杉屬植物引種后的生長(zhǎng)適應(yīng)性及枝葉中紫杉醇累積情況

曼地亞紅豆杉為灌木狀，葉片輪生，形態(tài)美麗，但在本地生長(zhǎng)緩慢，每年僅3～5月抽稍1次，長(zhǎng)度約10cm，生物量較低，不宜作為藥用植物原料林大規(guī)模發(fā)展，但可以作為盆景根據(jù)市場(chǎng)需求情況適度種植。中國(guó)紅豆杉、南方紅豆杉及云南紅豆杉在本地長(zhǎng)勢(shì)好，紫杉醇含量高，株間差異明顯，應(yīng)積極做好品種選育工作，有望獲得生長(zhǎng)快、紫杉醇含量高的優(yōu)株，對(duì)大規(guī)模發(fā)展紅豆杉種植作為藥用植物原料有積極推動(dòng)作用。

3.2 紅豆杉生長(zhǎng)與海拔高度的關(guān)系

在引種試驗(yàn)種植區(qū)內(nèi)分別選擇生長(zhǎng)環(huán)境基本一致的4個(gè)不同海拔高度的地點(diǎn)(梅縣雁洋鎮(zhèn)五指峰、南福村、石扇鎮(zhèn)松坪村、平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)古丁村)作為栽培試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行生長(zhǎng)情況調(diào)查，分別比較4年、8年樹齡的紅豆杉株高、冠幅、地徑、開花結(jié)實(shí)情況等，調(diào)查結(jié)果見表2。

表2 不同海拔紅豆杉生長(zhǎng)情況比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅豆杉對(duì)海拔高度的適應(yīng)范圍較寬，不同海拔調(diào)查指標(biāo)差別不大，說(shuō)明紅豆杉能在各種海拔的宜林地栽植。其中海拔高度為1000m的五指峰紅豆杉生長(zhǎng)成灌木狀(基部分枝多，地徑較大)，主要與山頂?shù)娜照?、風(fēng)力等影響因素相關(guān)。

3.3 紅豆杉生長(zhǎng)與光照強(qiáng)度的關(guān)系

在引種試驗(yàn)種植區(qū)內(nèi)分別選擇4個(gè)不同遮光條件下種植的各種紅豆杉，種植后第2年始連續(xù)3年跟蹤記錄苗木生長(zhǎng)情況、保存率等，結(jié)果見表3。

表3 光照強(qiáng)度對(duì)紅豆杉生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)區(qū)內(nèi)遮光度高的紅豆杉保存 率及生長(zhǎng)質(zhì)量較高，遮光度70%左右的紅豆杉保存率達(dá)到90%以上，長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片顏色深綠、葉片粗長(zhǎng)而厚;而遮光度低的紅豆杉葉片顏色發(fā)黃、葉片短小而薄，紅豆杉的死亡率較高;說(shuō)明紅豆杉在幼齡期需要適度的遮蔭才能正常生長(zhǎng)。

紅豆杉對(duì)光照度的要求較高，可能與紅豆杉的光飽和點(diǎn)相關(guān)，幼齡期紅豆杉的光飽和點(diǎn)低，葉片對(duì)光強(qiáng)的耐受力差，長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)光照射使葉片不能正常進(jìn)行光合作用進(jìn)而影響體內(nèi)新陳代謝，甚至死亡。隨著樹齡的增長(zhǎng)，紅豆杉的光飽和點(diǎn)逐步提高，植株對(duì)光強(qiáng)的適應(yīng)能力也有所提高。

3.4 紅豆杉枝葉中紫杉醇含量與樹齡的關(guān)系

以試驗(yàn)區(qū)內(nèi)南方紅豆杉為研究對(duì)象，種植后第2年始逐年剪取枝葉混合樣進(jìn)行紫杉醇含量的檢測(cè)，以考察隨著紅豆杉樹齡的增長(zhǎng)，枝葉中產(chǎn)物累積量的變化趨勢(shì)，為修剪紅豆杉枝葉作為制取紫杉醇的藥用原料提供依據(jù)。

表4 紅豆杉枝葉中紫杉醇含量與樹齡的關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果表明，種植年限為2～3年樹齡的紅豆杉枝葉中產(chǎn)物含量較高，達(dá)到0.02%左右，可作為制取紫杉醇的藥用植物原料;種植年限為4年以上樹齡的紅豆杉枝葉中紫杉醇含量較低，而根皮中的紫杉醇含量較高(可達(dá)到0.05% ～0.1%)，老齡的紅豆杉枝葉不宜作為制取紫杉醇的藥用原料。

種植年限為4年以上樹齡的紅豆杉枝葉中紫杉醇含量逐步降低，而根皮中含量逐步升高，這可能與紫杉醇的合成和貯存機(jī)制有關(guān)，紅豆杉枝葉是紫杉醇等產(chǎn)物的合成工廠，根皮是產(chǎn)物的貯存?zhèn)}庫(kù)，隨著樹齡的增長(zhǎng)，產(chǎn)物逐步被轉(zhuǎn)移至根皮中貯存。

4 結(jié)語(yǔ)

廣東省梅州市境內(nèi)早期種植的紅豆杉已能開花、結(jié)果、繁殖，紅豆杉在本地已引種成功;提高紅豆杉生長(zhǎng)質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)措施包括疏水、適度遮陽(yáng)、松土;紅豆杉枝葉中產(chǎn)物含量高低與品種、部位、季節(jié)、樹齡、撫育管理等因素相關(guān);開展紅豆杉的良種選育，進(jìn)而實(shí)施紅豆杉良種、良法的推廣工作是建設(shè)紅豆杉藥用林的關(guān)鍵。

［1］Wani M C，Taylor H L，Wall M E，et al.Plant antitumor agents.VI.The isolation and atructure of taxol，a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia［J］.J Amer Chem Soc，1971，93(9):2325～2327.

［2］周 進(jìn)，賀恩德，賀建國(guó)，等.曼地亞紅豆杉引種試驗(yàn)初步研究［J］.四川林業(yè)科技，2007，28(1):60 ～63.

［3］徐 平，廖建良，周紀(jì)剛.南方紅豆杉與云南紅豆杉的引種栽培試驗(yàn)［J］.江蘇林業(yè)科技，2001，28(4):24 ～25.

［4］李志良.中國(guó)紅豆杉和短葉紅豆杉的胚胎培養(yǎng)［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，10(1):62 ～63.

［5］李志良，何偉強(qiáng)，肖臘興，等.紅豆杉育苗及造林技術(shù)［J］.廣東林業(yè)科技，2011(6):92～95.

［6］廖富林，賴萬(wàn)年，許良政，等.廣東梅州野生珍稀瀕危藥用植物資源與保護(hù)［J］.中草藥，2005，36(4):606 ～608.