電針對(duì)抑郁模型大鼠五羥色胺及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

史榕荇 ，吳 茜 ，于戰(zhàn)歌 ，李 輝 ，田旭升 ，唐學(xué)章 ?

（1.中日友好醫(yī)院 針灸科，北京 100029；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

抑郁癥是精神疾患的常見(jiàn)病種，因?yàn)榘l(fā)病率高，知曉率低，危害嚴(yán)重，給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，抑郁癥的預(yù)防和治療得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，但由于發(fā)病機(jī)制至今沒(méi)有得到肯定、明確的揭示，其發(fā)病率不降反升[1]。

近現(xiàn)代以來(lái)，臨床醫(yī)生將電針療法廣泛應(yīng)用于抑郁癥的治療，取得肯定的療效，認(rèn)為電針對(duì)抑郁癥起整體調(diào)節(jié)作用，可以干預(yù)機(jī)體恢復(fù)固有的動(dòng)態(tài)平衡。1984年，羅和春[2]開(kāi)始對(duì)電針治療抑郁癥進(jìn)行規(guī)范化研究，為電針的作用機(jī)制提供了頗具說(shuō)服力的科學(xué)佐證。

迄今為止，比較明確的是腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經(jīng)系統(tǒng)失衡改變與抑郁癥發(fā)病有直接的關(guān)系[3]，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞具營(yíng)養(yǎng)作用，而5-HT能神經(jīng)元與BDNF因子之間存在交互作用。有實(shí)驗(yàn)得出電針可抑制HPA軸亢進(jìn)，同時(shí)提高損傷大腦海馬內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)[4]。本研究觀察了電針對(duì)抑郁模型大鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF含量表達(dá)的影響，以探討電針調(diào)整抑郁癥大腦功能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和分組

雄性 SD 大鼠，120 只，體重 160～180g，維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。通過(guò)開(kāi)野實(shí)驗(yàn)將水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)加垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)不足30次或超過(guò)120次的大鼠剔除，選取符合條件大鼠40只隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)期間除特殊要求外，其余時(shí)間均飼養(yǎng)于溫度（18℃～25℃）和濕度（55%±2%）相對(duì)恒定的動(dòng)物飼養(yǎng)室，自然光線，自由進(jìn)食水；隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、抑郁模型組、陽(yáng)性西藥對(duì)照組（氟西?。?、電針治療組，每組10只。

1.2 造模和干預(yù)方式

造模動(dòng)物全部孤養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間每天隨機(jī)給予一種應(yīng)激刺激，包括斷食（24h）、斷水（24h）、晝夜顛倒（24h）、夾尾（180s）、溫箱（40℃，5min）、冷水游泳（14℃，5min）、電擊足底（電壓 30V，電擊 5s，間歇5s，共進(jìn)行120s）平均每種刺激3次，共21d。參照 “實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”（全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定）選取大鼠百會(huì)、印堂穴，平刺進(jìn)針，百會(huì)穴針尖方向向后頭部，印堂穴針尖方向向鼻尖，刺入深度約為0.5～1cm，使用HANS，LH202型電針治療儀0.6mA/2Hz，每次造模前1h對(duì)電針組行電針干預(yù)，1次/d，每次20min，共21d。造模期間，每天應(yīng)激刺激前1h西藥對(duì)照組灌胃給藥氟西?。╢luoxetine，氟西汀），美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)，批號(hào) 104041，按 0.18mg/kg體重，0.018mg/ml濃度灌胃給藥，1次/d，共21d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法樣品制備及檢測(cè)

最后一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠斷頭于冰皿上快速剝離海馬，用生理鹽水沖洗干凈，立即放入清潔的5ml塑料離心管中，置于－85℃冰箱中備用，檢測(cè)5-HT的含量。

檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)用試劑盒由北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供，美國(guó)Biosource公司生產(chǎn)。

1.3.2 Western-blot法樣品制備及檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)用抗體：羊抗兔抗BDNF為美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；DYY-Ⅲ-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀，北京市六一儀器廠；X光膠片自動(dòng)沖洗機(jī)為美國(guó)Proce公司產(chǎn)品；FluochemV2.0型凝膠圖像分析系統(tǒng)為美國(guó)阿爾法公司產(chǎn)品。

使用超聲勻漿器在冰上迅速研碎海馬組織；加入400μl含PMSF的變性裂解緩沖液，在冰上放置30min；裂解30min后，用移液器將裂解液移至2ml離心管中，4℃，12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置-20℃保存。使用紫光分光光度法測(cè)樣品中蛋白濃度。取10μl樣品，稀釋40倍至400μl，置分光光度計(jì)中檢測(cè)OD260和OD280。計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白含量，取含50μg蛋白的樣品溶液，加入1/4體積5×buffer，混合后于沸水中煮10min使蛋白變性，等待上樣；加入樣品，接通電源開(kāi)始電泳，條帶在積層膠范圍時(shí)使用80V電壓，到達(dá)分離膠時(shí)改用120V電壓。半干式電轉(zhuǎn)移法將膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上，封閉實(shí)施免疫反應(yīng)，加入一抗，4℃過(guò)夜。用封閉液將抗兔二抗以1：2000比例稀釋?zhuān)瑢ⅵ?Actin所處部位的膜置于抗體溶液中，排盡氣泡，分別密閉袋口，室溫緩緩搖動(dòng)1h。暗室中，將膜蛋白面朝上放入X光片夾中，曝光2min后洗出膠片。用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片，并分析目標(biāo)條帶的分子量和凈光密度值。目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電針對(duì)抑郁模型大鼠海馬內(nèi)5-HT的影響

由表1可見(jiàn)，給予慢性應(yīng)激刺激后，模型組大鼠海馬5-HT含量較正常組顯著減少 （P＜0.01），電針組大鼠海馬5-HT含量較模型組顯著增加（P＜0.01）。

表1 電針對(duì)抑郁模型大鼠海馬5-HT含量的影響（x-±s）

表2 各組BDNF蛋白含量的比較（x-±s）

圖1 BDNF在海馬組織表達(dá)的蛋白印記圖

2.2 電針對(duì)抑郁模型大鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白含量表達(dá)的影響

由表 2及圖1的Western blot印跡結(jié)果可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠海馬中BDNF蛋白均有表達(dá)，與正常組相比，模型組BDNF蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；電針組蛋白表達(dá)量較模型組顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

電針和電休克療法（ECT）均對(duì)頭部進(jìn)行電流刺激，二者作用機(jī)制可能有相似之處。有研究表明，ECT可改變大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域多個(gè)基因表達(dá)，這些基因參與多條神經(jīng)傳導(dǎo)通路，而其中CREB（cAMP response element binding）-BDNF 通路為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。有研究[5]表明，改變CREBBDNF通路相關(guān)基因的表達(dá)，阻斷、逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元細(xì)胞的萎縮和凋亡，對(duì)恢復(fù)腦的功能可產(chǎn)生積極意義。電刺激通過(guò)改變抑郁癥神經(jīng)可塑性基因的表達(dá)而改善抑郁癥癥狀，為電針干預(yù)抑郁癥神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)的研究提供了新思路[6]。

有藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-HT再攝取抑制劑等藥物治療的起效出現(xiàn)延遲，時(shí)間約為4～6周，這表示該種機(jī)制僅為抑郁癥發(fā)病機(jī)制的一部分，而神經(jīng)可塑性機(jī)制的存在，一定程度上解釋了這種效應(yīng)延遲現(xiàn)象[7]。我們的研究證實(shí)：模型大鼠出現(xiàn)海馬內(nèi)5-HT含量降低，同時(shí)觀察到腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)降低，說(shuō)明抑郁狀態(tài)下BDNF表達(dá)降低，神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)障礙，這是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、功能受損可能的原因。電針能夠有效抑制模型大鼠海馬內(nèi)5-HT水平變化，同時(shí)增加海馬內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)含量，維持神經(jīng)可塑性、保護(hù)神經(jīng)功能產(chǎn)生良性調(diào)節(jié)，這是電針對(duì)抑郁模型大鼠產(chǎn)生良性干預(yù)作用可能的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，電針可同時(shí)對(duì)5-HT系統(tǒng)和腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生良性干預(yù)，再次印證了電針對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的平衡調(diào)節(jié)作用，這是電針起效迅速，而無(wú)毒副作用等不良反應(yīng)的可能原因。

本研究為電針對(duì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子影響觀測(cè)的初步結(jié)果，至于電針在整條神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)通路中如何起效，電針調(diào)節(jié)CREB-BDNF通路上多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的機(jī)制，以及電針調(diào)整5-HT系統(tǒng)與腦源性神經(jīng)經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子系統(tǒng)之間交互作用的內(nèi)在聯(lián)系等問(wèn)題，尚待進(jìn)一步探討和研究。

[1]黃泉智，許成勇，王發(fā)渭.中醫(yī)治療抑郁癥的現(xiàn)狀與展望[J].中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2011，13（2）：77-78.

[2]羅和春，錢(qián)瑞琴.中西醫(yī)結(jié)合治療抑郁癥新進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（3）：197-198.

[3]王樹(shù)桂，潘瑩.抑郁癥藥物治療進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2011，（1）：35-36.

[4]李文迅，韓焱晶，陶娟，等.電針對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡影響的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（2）：33-35.

[5]Altar CA，Laeng P，Jurata LW，et al.Electroconvulsive seizutes regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways[J].J Neurosci，2004，24：2667-2677.

[6]Molteni R，Calabrese F，Bedogni F，et al.Chronic treatment with fluoxetine up-regulates celluar BDNF mRNA expression in rat dopaminergic regions[J].Int J Neuropsychopharmacol，2006，9：307-317.

[7]徐林.抑郁癥的神經(jīng)可塑性機(jī)制[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，34：326-330.