虎尾蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

黃鳳蘭，李 靜，張 茜，張 群，趙玲玲，聶民利

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

虎尾蘭（Sansevieria trifasciatavar.harnii）又稱虎皮蘭、千歲蘭，是龍舌蘭科虎尾蘭屬，多年生常綠肉質(zhì)草本植物[1]，原產(chǎn)非洲西部，具有較強(qiáng)的耐寒性，且極少發(fā)生病蟲害，養(yǎng)護(hù)較為容易[2]。同時(shí)還有凈化空氣的功效，是優(yōu)良的室內(nèi)環(huán)保植物，被人們稱為“天然的清道夫”[3-5]?；⑽蔡m的常規(guī)繁殖是用扦插或分株方法[6]，但是扦插和分株法繁殖率低，時(shí)間較長(zhǎng)，而且不易獲得大量的植株，且會(huì)出現(xiàn)品種退化現(xiàn)象，金邊虎尾蘭金邊性狀易消失，影響觀賞質(zhì)量[7]。而采用組織培養(yǎng)育苗方法具有繁殖系數(shù)高、保持原品種特性、避免種性分離、種苗不帶病毒、生長(zhǎng)一致等優(yōu)點(diǎn)，從而使種苗生產(chǎn)達(dá)到規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化和工廠化的目標(biāo)。本試驗(yàn)以短葉虎尾蘭為研究對(duì)象進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，以葉片為外植體，誘導(dǎo)其再生植株，摸索虎尾蘭在不同的組織培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)條件，從而為短葉虎尾蘭的組織培養(yǎng)體系的建立奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用生長(zhǎng)健壯的短葉虎尾蘭葉片為試材（見圖1），2009～2010年期間在內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院組培室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[8-10]，加入不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH 5.6～5.8，室內(nèi)培養(yǎng)溫度（25±2）℃，每天光照12 h，光強(qiáng)1 500 lx。

圖1 短葉虎尾蘭Fig.1 Short leaf orchid

1.3 方法

1.3.1 材料的消毒處理及升汞滅菌時(shí)間的篩選

剪取幼嫩的葉片，用流水沖洗30 min以上，再用75%的酒精處理30 s，在0.1%的HgCl2中滅菌，時(shí)間設(shè)定3、5和8 min共3個(gè)梯度，然后用無菌水涮洗8～10次，接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。觀察污染情況，計(jì)算污染率。污染率（%）=污染的外植體個(gè)數(shù)（個(gè)）/接種的外植體個(gè)數(shù)（個(gè)）×100%。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)階段植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（PGR）最佳濃度配比的篩選

將消毒處理過的外植體分別接種到MS+6-BA（1、2、3 mg·L-1）+NAA（0.3、0.5、0.8 mg·L-1）+2，4-D（0.3、0.5、0.8 mg·L-1）共28個(gè)處理組合的培養(yǎng)基中（見表1），25 d后統(tǒng)計(jì)各處理組合萌動(dòng)的外植體數(shù)和誘導(dǎo)出的愈傷外植體數(shù)，計(jì)算萌動(dòng)率（%）=萌動(dòng)的外植體個(gè)數(shù)（個(gè)）/接種的外植體個(gè)數(shù)（個(gè)）×100%和愈傷誘導(dǎo)率（%）=長(zhǎng)愈傷的外植體數(shù)（個(gè)）/接種的外植體數(shù)（個(gè)）×100%，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行下一步試驗(yàn)，計(jì)算平均相對(duì)生長(zhǎng)速率（%）=30 d增重量（g）/原有重量(g)×100%[11]。

1.3.3 愈傷組織分化階段PGR最佳濃度配比的篩選

將胚狀體分別接種到MS+6-BA（1、2、3、4 mg·L-1）+NAA（0.3、0.5、0.8、1.0 mg·L-1）共 16 個(gè)處理組合的培養(yǎng)基中（見表2），接種40 d后開始統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理外植體長(zhǎng)芽的個(gè)數(shù)，計(jì)算分化率。分化率（%）=芽的個(gè)數(shù)（個(gè)）/接種的胚狀體數(shù)（個(gè)）×100%，篩選出芽誘導(dǎo)階段的最佳PGR配比。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)階段的PGR濃度配比Table 1 Ratio of PGR concentration at callus induction phase

表2 芽誘導(dǎo)階段的PGR濃度配比Table 2 Ratio of PGR concentration at bud induction phase

1.3.4 生根階段NAA最佳濃度的篩選

目前凈水器產(chǎn)業(yè)雖然已經(jīng)比較成熟，但產(chǎn)品依舊存在很多難點(diǎn)需要攻克。例如凈水器凈化速度慢、凈化效果無法確認(rèn)、廢水比太高、噪音大等等問題。盡善盡美無論任何事物都無法做到，但兩全其美的凈水器卻是能夠?qū)崿F(xiàn)的。

將芽分別接種到MS+NAA（0.0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg·L-1）共6個(gè)處理的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種1瓶，3個(gè)芽，接種37 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，篩選出根誘導(dǎo)階段的最佳NAA濃度。

1.3.5 煉苗、移栽

待培養(yǎng)苗的根長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)即可煉苗、移栽。煉苗時(shí)需要去除封口膜，在培養(yǎng)基表面加上薄薄的一層自來水，至于散射光下3～5 d。移栽后，最初10～15 d要通過噴霧或罩上透明的塑料以保持很高的濕度（90%～100%），在塑料罩上打些小孔，以利于氣體交換。在保濕數(shù)天后，可把植株搬入溫室，但仍須遮陰數(shù)日，4～6周后即可讓小苗在正常的溫室或田間條件下生長(zhǎng)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳升汞消毒時(shí)間的篩選結(jié)果

將外植體分別用0.1%的升汞處理3、5和8 min，15 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可以看出，升汞消毒3 min接種的外植體沒有污染，升汞消毒5 min和升汞消毒8 min接種的外植體污染率也很低，但是考慮到升汞對(duì)外植體有毒害，所以選擇升汞的消毒時(shí)間為3 min。

圖2 剛接種后的虎尾蘭葉片的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 Growth state of orchid blade inoculated justly

表3 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體生長(zhǎng)狀況的影響Table 3 Effect of different sterilization time on explants growth state

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)階段生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（PGR）最佳濃度配比的篩選

將葉片接種到MS培養(yǎng)基中，1～15號(hào)處理在10月12日接種，接種54 d后觀察生長(zhǎng)狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。由表4可知，5、9、13號(hào)處理與其他處理相比較萌動(dòng)率和愈傷誘導(dǎo)率均比較高。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)好且狀態(tài)一致的愈傷組織材料分別接種到5、9、13、16、22、23號(hào)處理中，接種時(shí)間為1月14日，于接種后30 d觀察統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其平均生長(zhǎng)速率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。由表6可以看出，5號(hào)處理與其他處理相比較，平均相對(duì)生長(zhǎng)速率增加最多，達(dá)到42.3%，因此5號(hào)PGR濃度（1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D）最適合誘導(dǎo)愈傷組織（見圖3）。

2.3 愈傷組織分化階段PGR最佳濃度配比的篩選結(jié)果

將狀態(tài)一致的胚性愈傷組織在1月14日分別接種到1～16號(hào)處理中，接種后60 d觀察胚性愈傷組織的生芽狀況并統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表7。由表7可以看出，9號(hào)處理的芽分化率最高，達(dá)到233%。由此可知，9號(hào)處理PGR的配比濃度（1 mg·L-16-BA+0.8 mg·L-1NAA）適宜誘導(dǎo)芽的生成（見圖4）。

表4 愈傷誘導(dǎo)階段接種54 d后不同PGR濃度外植體的生長(zhǎng)狀況Table 4 Growth state of explants of different PGR concentrations in callus induction stages after 54 d inoculation

表5 愈傷誘導(dǎo)階段接種40 d后不同PGR濃度外植體的生長(zhǎng)狀況Table 5 Growth state of explants of different PGR concentrations in callus induction of stages after 40 d inoculation

表6 愈傷組織誘導(dǎo)階段外植體的增重狀況Table 6 Weight status of explants in callus induction stage

圖3 長(zhǎng)胚性愈傷的外植體Fig.3 Explants of embryogenic callus

圖4 長(zhǎng)芽的胚狀體Fig.4 Embryoids growing buds

表7 愈傷組織分化階段胚狀體的生長(zhǎng)狀況Table 7 Growth state of embryoid in callus induction stage

2.4 生根階段NAA的最佳濃度的篩選結(jié)果

將幼苗轉(zhuǎn)移到不同NAA濃度的MS生根培養(yǎng)基中，2月27日接種，在接種38 d后觀察芽的生根情況并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表8。由表8可知，1號(hào)處理的生根率最高達(dá)到100%，而且根的狀態(tài)很好，因此1號(hào)處理的NAA濃度（0.1 mg·L-1）適宜誘導(dǎo)根的生成（見圖5）。

表8 生根階段根的生長(zhǎng)狀況Table 8 Growth state of roots in rooting stage

圖5 生根的芽Fig.5 Buds grow root

3 討 論

3.1 葉片的選擇時(shí)期

試驗(yàn)選材應(yīng)選擇生長(zhǎng)一段時(shí)間的嫩葉片。在試驗(yàn)過程中，選取的材料有新生長(zhǎng)出來的幼嫩葉片，生長(zhǎng)一段時(shí)間的嫩葉片和老葉片，觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，老化的葉片，雖然未受到升汞的傷害但是愈傷誘導(dǎo)率非常低。剛生長(zhǎng)出來的嫩葉片，容易受到升汞的傷害導(dǎo)致死亡而不能萌動(dòng)產(chǎn)生愈傷組織。

3.2 組織培養(yǎng)苗的退化

虎尾蘭的品種有很多，繁殖的方法有扦插和分株法，但是金邊和銀邊虎尾蘭要保持其優(yōu)良品種特性，避免出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，只能用分株法，這就使其繁殖速率大大的降低，不能滿足市場(chǎng)的需求，而利用組織培養(yǎng)方法快繁虎尾蘭植株，既能提高植株繁殖速率，又能保持原品種的特性。

3.3 升汞的消毒時(shí)間

升汞雖然是劇毒物質(zhì)，但是對(duì)外植體有很好的消毒效果，一般在組織培養(yǎng)時(shí)都會(huì)選擇升汞對(duì)外植體進(jìn)行消毒。消毒時(shí)間的長(zhǎng)短隨植物的不同而有差異，本試驗(yàn)對(duì)虎尾蘭葉片的消毒時(shí)間進(jìn)行了摸索，以保證既能達(dá)到很好的消毒效果，又不會(huì)對(duì)外植體造成傷害，本試驗(yàn)得出的結(jié)果是0.1%升汞消毒時(shí)間為3 min。但是1987年婁淵祥等以虎皮蘭葉片為外植體快繁虎皮蘭，其0.1%的HgCl2的消毒時(shí)間為8 min[9]，為了避免外植體造成傷害，消毒時(shí)間越短越好，所以既然消毒3 min的效果也很好，最好選擇3 min。

3.4 IBA對(duì)生根的影響

IBA也同NAA一樣可誘導(dǎo)芽快速的生根，本試驗(yàn)沒有對(duì)其進(jìn)行研究，對(duì)于IBA的濃度對(duì)生根率的影響有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

虎尾蘭葉片表面用0.1%升汞消毒3 min，污染率低，褐化/死亡率低，成活率高，效果最好。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D最有利于愈傷組織的生成。誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基以MS+1 mg·L-16-BA+0.8 mg·L-1NAA為最佳，不僅生成的芽多，而且健壯。生根培養(yǎng)基以MS+0.1 mg·L-1NAA最有利于根的生成，根的生長(zhǎng)速度快，質(zhì)量好。

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