鼻息肉組織中COX-2與NF-κB p65的表達(dá)與關(guān)系

董文匯 盧 杰

（1 山東省濰坊市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，山東 濰坊 261041；2 山東省濰坊市坊子區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，山東 濰坊 261041）

鼻息肉是耳鼻咽喉科的常見病、多發(fā)病，部分患者手術(shù)后的復(fù)發(fā)及術(shù)后需要長(zhǎng)期換藥目前仍是一個(gè)難題，主要原因是鼻息肉的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全明確[1]，因此對(duì)鼻息肉的病因和發(fā)病機(jī)理等方面的相關(guān)研究具有重要的臨床意義。本研究是應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜組織中的COX-2與NF-κBp65的表達(dá)，以分析COX-2與NF-κBp65在鼻息肉發(fā)生、發(fā)展等方面的作用和二者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

試驗(yàn)對(duì)象40例，均為2008年10月至2009年10月在坊子區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科住院接受FESS的鼻息肉患者，其中男性26例，女性14例，年齡19～61歲，平均（30.2±10.1）歲，每例標(biāo)本均經(jīng)病理確診為鼻息肉，且術(shù)前未經(jīng)類固醇藥物治療，未服用非甾體類消炎藥。所有患者按1997年?？跁?huì)議標(biāo)準(zhǔn)[2]（以手術(shù)取標(biāo)本側(cè)鼻腔為準(zhǔn)）進(jìn)行臨床分型分期：2型1期18例，2型2期14例，2型3期6例，3型2例。其中單側(cè)發(fā)病25例，雙側(cè)發(fā)病15例（其中復(fù)發(fā)病例5例）。對(duì)照組20例下鼻甲黏膜標(biāo)本取自同期因鼻中隔偏曲經(jīng)手術(shù)治療的患者的正常下鼻甲黏膜組織（患者無(wú)全身疾病，無(wú)變態(tài)反應(yīng)病史，無(wú)慢性鼻炎鼻竇炎病史）。

1.2 試劑、試劑盒

兔抗人環(huán)氧化物酶2（COX-2）單克隆抗體、SP-9001免疫組化試劑盒、濃縮型DAB酶底物顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液等均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

標(biāo)本采集后進(jìn)行HE常規(guī)染色及免疫組化染色前制備，制備好的每例標(biāo)本隨機(jī)抽取相鄰連續(xù)切片分別作HE常規(guī)染色及COX-2與NF-κBp65免疫組化染色，觀察兩種抗體蛋白表達(dá)，整個(gè)染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。免疫組化染色采用SP方法。用已知陽(yáng)性片（COX-2陽(yáng)性組織切片為乳腺癌、NF-κBp65陽(yáng)性組織切片為膠質(zhì)瘤）作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液取代一抗作陰性對(duì)照，以排除非特異性染色。

COX-2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和核膜。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及核膜出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞[3]。NF-κBp65的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞[4]。在高倍鏡（400倍）下記數(shù)300個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)Krajewska等[5]半定量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷，從細(xì)胞染色強(qiáng)度和所占面積的比例兩方面評(píng)分，二者之積為最終結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分： 0分=陰性染色，與背景色一致；1分=弱陽(yáng)性染色，淡黃色；2分=陽(yáng)性染色，黃色；3分=強(qiáng)陽(yáng)性染色，棕黃色。所占面積評(píng)分：0分=陽(yáng)性細(xì)胞占＜10%；1分=陽(yáng)性細(xì)胞占10～25%；2分=陽(yáng)性細(xì)胞占26～50%；3分=陽(yáng)性細(xì)胞占51 ～75%；4分二陽(yáng)性細(xì)76～100%。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：二者半定量積分＜3分為陰性表達(dá)，4～6分為弱陽(yáng)性（+），7 ～9分為陽(yáng)性（++），10～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陰性到+++分別賦值0到3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS14. 0統(tǒng)計(jì)軟件包，組間差異比較運(yùn)用卡方檢驗(yàn)、Fisher精確概率法。相關(guān)性分析運(yùn)用spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05（單側(cè)）認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2在鼻息肉組和下鼻甲組中的表達(dá)

COX-2的陽(yáng)性表達(dá)：40例鼻息肉標(biāo)本中有30例（75%）出現(xiàn)COX-2的陽(yáng)性表達(dá)，主要在鼻息肉組織中的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞和上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核膜上呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。而在下鼻甲黏膜中極少見到陽(yáng)性染色，20例下鼻甲黏膜組織中僅見1例（5%）弱陽(yáng)性表達(dá)。COX-2在鼻息肉組織黏膜上皮細(xì)胞，炎性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著高于下鼻甲組，兩組的差異具有顯著性意義（P=0.0000，P＜0.01）（表1）。

表1 NF-κBp65和COX-2在NP和下鼻甲組的表達(dá)

2.2 NF-κBp65在鼻息肉組和下鼻甲組中的表達(dá)

NF-κBp65的陽(yáng)性表達(dá)：40例鼻息肉標(biāo)本有34例（85%）出現(xiàn)NF-κBp65的陽(yáng)性表達(dá)，主要在鼻息肉組織黏膜的上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和部分胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。NF-κBp65在下鼻甲黏膜上皮、黏膜下浸潤(rùn)炎性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和部分胞核內(nèi)也有少許表達(dá)，在20例下鼻甲標(biāo)本組織發(fā)現(xiàn)有5例（25%）標(biāo)本出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。NF-κBp65在鼻息肉組織黏膜上皮細(xì)胞，炎性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著高于下鼻甲組，且差異具有顯著性（P=0.0000，P＜0.01）（表1）。

2.3 NF-κBp65和COX-2的相關(guān)性

NF-κBp65和COX-2在鼻息肉組織中均呈現(xiàn)了高表達(dá)，在40例鼻息肉標(biāo)本組織中的34例NF-κBp65呈陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)本中，COX-2的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為29例，而在6例NF-κBp65陰性表達(dá)的標(biāo)本中，COX-2的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為1例，進(jìn)一步行相關(guān)性分析，二者呈顯著的正相關(guān)（r=0.817，P=0.0006，P＜0.01）（表2）。

表2 NF-κBp65與COX-2的相關(guān)性研究

3 討 論

環(huán)氧化酶2（COX-2）是花生四烯酸（AA）合成前列腺素（PG）過程中的一個(gè)重要的限速酶，磷脂酶A活化后水解膜磷脂，釋放花生四烯酸，花生四烯酸在環(huán)氧化酶的催化下生成前列腺素。近年來(lái)的研究證實(shí)COX-2具有多種功能，并與鼻息肉的發(fā)病有著諸多可能的關(guān)聯(lián)：①COX-2的催化產(chǎn)物PG能擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，趨化嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，造成局部組織的水腫。②COX-2在組織中的高表達(dá)能夠使細(xì)胞黏附分子（ICAM）的表達(dá)增加[6]，已有研究證實(shí)ICAM能促進(jìn)奏息肉中嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)[7]。③COX-2能促進(jìn)血管形成，在腫瘤的研究中已證實(shí)COX-2的高表達(dá)可以促進(jìn)血管通透因子（VEGF）的生成[8]，已有研究證實(shí)VEGF在鼻息肉組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腺體細(xì)胞的表達(dá)明顯高于下鼻甲組織[9]，VEGF對(duì)鼻息肉發(fā)生過程中組織極度水腫的產(chǎn)生有非常重要的作用。④COX-2與誘導(dǎo)型氧化氮合酶（iNOS）有協(xié)同作用，Masferer和Izutain等[10]的研究表明，表達(dá)COX-2的上皮細(xì)胞亦表達(dá)iNOS，二者有協(xié)同作用。已有研究證實(shí)在鼻息肉中iNOS的表達(dá)明顯高于下鼻甲，并推測(cè)iNOS及NO通過增加血管通透性等作用使血漿滲出增多，局部水腫，參與鼻息肉的形成[11]。⑤④Liu等報(bào)道COX還能調(diào)節(jié)白介素的表達(dá)，進(jìn)而促成鼻息肉生成[12]。⑥COX-2能抑制細(xì)胞凋亡，COX-2的高表達(dá)可使細(xì)胞凋亡抑制基因（bcl-2）水平上調(diào)[13]，已有研究證實(shí)bcl-2在鼻息肉黏膜上皮、嗜酸細(xì)胞、腺體中的表達(dá)明顯高于下鼻甲，故COX-2有可能抑制嗜酸細(xì)胞凋亡，促進(jìn)鼻息肉上皮細(xì)胞增殖[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:鼻息肉組中的COX-2的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于下鼻甲黏膜組（P＜0.01），提示COX-2可能通過調(diào)解前列腺素和其他炎性介質(zhì)的合成及活性進(jìn)而在鼻息肉的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)使用的是小鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體，免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NF-κBp65陽(yáng)性表達(dá)主要分布在鼻息肉及下鼻甲組織黏膜上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和部分胞核內(nèi)，在兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示NF-κBp65參與鼻息肉的發(fā)生過程。鼻黏膜不僅構(gòu)成防止有害物質(zhì)進(jìn)入黏膜下第一道機(jī)械屏障，而且主動(dòng)參與機(jī)體的免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中下鼻甲黏膜也有少量的NF-κBp65的活化狀態(tài)，暗示NF-κBp65可能參與維持下鼻甲的生理功能或與下鼻甲最輕持續(xù)炎癥反應(yīng)有關(guān)。也就是說(shuō)，鼻黏膜可能處在一個(gè)輕微的但持續(xù)的炎性反應(yīng)狀態(tài)，并使組織炎性反應(yīng)局限在很小的幅度之內(nèi)[15]。本實(shí)驗(yàn)中NF-κBp65在下鼻甲黏膜組及鼻息肉組的上皮細(xì)胞層的表達(dá)依次增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，提示NF-κBp65在兩組的炎癥反應(yīng)中的作用可能在增強(qiáng)，而且兩種組織的黏膜上皮層可能參與了與NF-κBp65有關(guān)的細(xì)胞因子的分泌和調(diào)節(jié)。

COX-2與NF-κBp65的表達(dá)在鼻息肉組織中的表達(dá)明顯高于下鼻甲組織黏膜，提示二者在鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用。在鼻息肉組織中COX-2與NF-κBp65的表達(dá)呈正相關(guān)，這提示NF-κBp65在COX-2的表達(dá)中起重要的作用。本研究表明COX-2在鼻息肉發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，這為COX-2抑制劑應(yīng)用于鼻息肉的防治提供了理論依據(jù)。NF-κBp65可能在鼻息肉中COX-2過度表達(dá)中起著重要的作用，對(duì)二者以及其上下游各種因子的研究將為闡明鼻息肉發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供幫助，從而發(fā)現(xiàn)更多的鼻息肉的治療靶點(diǎn)。

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