HBV特異性CTLs表面CD244和PD－1共表達(dá)與慢性乙型肝炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性*

王 姣， 鄧 洪△， 謝冬英， 朱建蕓， 胡朝霞， 梅明珠， 高志良

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1感染性疾病科，2疫苗研究所，廣東 廣州 510630)

乙型肝病病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝性、非細(xì)胞毒性的DNA病毒，在嬰幼兒時(shí)期感染者極易演變?yōu)槁砸倚透窝?chronic hepatitis B，CHB)[1]。HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸與機(jī)體免疫密切相關(guān)，其中細(xì)胞免疫尤其是HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T－lymphocytes，CTLs)在病毒清除過程中起著重要的作用[2]。但是研究發(fā)現(xiàn)HBV慢性感染者體內(nèi)HBV特異性CTLs存在數(shù)量和質(zhì)量上的缺陷，不能有效地清除病毒，且其機(jī)制并不十分明確[3]。程序性死亡蛋白1(programmed death 1 protein，PD－1)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的最具代表的負(fù)性共刺激信號分子，其高表達(dá)與T細(xì)胞免疫缺陷密切相關(guān)，是導(dǎo)致 T淋巴細(xì)胞功能耗竭的重要機(jī)制之一[4－5]。近年來研究者們認(rèn)為，機(jī)體內(nèi)還存在其它的負(fù)性共刺激信號分子，協(xié)同PD－1調(diào)控T淋巴細(xì)胞的免疫功能[6]。CD244，也稱 2B4，研究者發(fā)現(xiàn)其在 HBV[7]和 丙 型 肝 炎 病 毒 (hepatitis C virus，HCV)[8]感染者體內(nèi)高表達(dá)，并發(fā)揮免疫抑制的作用。由于PD－1和CD244共表達(dá)與HBV感染慢性化后疾病進(jìn)程的相關(guān)性尚不清楚，本研究的目的在于通過檢測不同臨床類型的慢性HBV感染者外周血總T細(xì)胞及HBV特異性CTLs上CD244和PD－1共表達(dá)差異，探討PD－1和CD244共表達(dá)與CHB不同疾病進(jìn)程的關(guān)系。

材料和方法

1 研究對象

81例HLA－A2陽性CHB患者均來自2010年7月至2012年5月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科病房或者門診，年齡在16～63歲之間，平均年齡(38.2±11.0)歲;男性 75例，女性6例;其中包括免疫耐受期(immune tolerant，IT)7例，輕、中度CHB(mild and moderate CHB，m －CHB)34例，重度 CHB(severe CHB，s－CHB)20例，慢加急性肝衰竭(acute－on－chronic liver failure，ACLF)20 例，見表 1。診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[1]及2005年《肝衰竭診療指南》[9]，同時(shí)排除合并其它類型肝炎病毒感染、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、自身免疫性疾病、腫瘤、孕婦及嚴(yán)重基礎(chǔ)病等患者。健康對照(healthy controls，HC)14例，均為健康獻(xiàn)血人員，見表1。本研究已通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了研究對象的知情同意。

表1 研究對象的基本情況Table1.Characteristics of the study population()

表1 研究對象的基本情況Table1.Characteristics of the study population()

ALT:alanine aminotransferase;TBIL:total bilirubin;PT:prothrombin time;HBsAg:hepatitis B surface antigen;HBeAg:hepatitis B e－antigen;HBeAb:hepatitis B e－antibody;HBV DNA:hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

P a r a m e t e r H C I T m－C H B s－C H B A C L F P n 14 7 34 20 20 －A g e(y e a r) 29.21±4.87 25.43±6.85 33.14±8.80 39.06±99.42 46.53±10.80 ＜0.01 S e x(f e m a l e/m a l e) 2/12 1/6 3/31 2/18 1/19 ＞0.05 A L T(U/L) － 33.20±14.45 807.40±538.90 799.20±584.80 694.20±570.20 ＜0.01 T B I L(μ m o l/L) － 13.12±5.28 50.15±32.13 244.40±147.60 388.70±169.60 ＜0.01 P T(s) － － 14.79±2.34 15.40±2.06 27.56±6.41 ＜0.01 H B s A g(10 3 U/L) － + 5582.70±8320.00 6236.10±3145.20 5996.60±2142.60 ＞0.05 H B e A g(p o s t i v e/n e g a t i v e) － 7/0 18/16 12/8 5/15 ＞0.05 H B e A b(p o s t i v e/n e g a t i v e) － 0/7 19/15 12/8 15/5 ＞0.05 H B V D N A[l o g 10(10 3 U/L)]－ 6.92±2.19 6.96±1.19 6.94±1.21 5.88±1.38 ＜0.05

2 主要試劑和儀器

BD FACS LSRII型流式細(xì)胞儀。熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體HLA－A2－PE、CD3－FITC、CD8－APC－Cy7、PD－1－ PE－Cy7(Clone:MIH1)和 IgG1(K isotype)－PE－Cy7購于BD Bioscience。CD244－APC(Clone:eBioPP35)和 IgG1(K isotype)－APC購于eBioscience。IFN－γ－ Brilliant Violet 421購于Biolegend。R－PE標(biāo)記的Pro5 MHC pentamer HLA－A*02:01/FLPSDFFPSV(HBV Tc18－27)購于Proimmune。LymphoprepTM淋巴細(xì)胞分離液購于AXISSHIELD，胎牛血清和RPMI－1640培養(yǎng)基+HEPES購于Gibco。佛波酯(phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA)和離子霉素鈣鹽(ionomycin calcium salt)購于Sigma，莫能星(monensin)購于BioLeged。

3 方法

3.1 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞及HLA－A2流式分型采集EDTA抗凝新鮮外周血10 mL，利用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后懸于 PBS中，調(diào)整濃度1×1010cells/L。分別取1×105PBMC加入含100 μL PBS的檢測管和對照管中，加入anti－HLA－A2－PE及同型對照10 μL，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測。

3.2 流式細(xì)胞儀檢測HBV特異性 CTLs頻率及CD244、PD－1分子的表達(dá) 取5×106個(gè)PBMC重懸于100 μL PBS中，加入10 μL R －PE 標(biāo)記的 Pro5 MHC pentamer HLA－A*02:01/FLPSDFFPSV(HBV Tc18－27)，室溫孵育15 min，PBS洗滌后，350×g離心去上清，加入 anti－CD3－FITC、anti－CD8－anti－APC－Cy7、anti－PD－1－PE－Cy7和anti－CD244－APC，4℃孵育30 min。PBS洗滌后，350×g離心去上清，加4%多聚甲醛200 μL重懸后，流式細(xì)胞儀檢測。每份標(biāo)本均設(shè)同型對照。以淋巴細(xì)胞為門，計(jì)數(shù)2×106個(gè) T細(xì)胞，設(shè) CD3+、CD8+、HLA－肽五聚體三陽性細(xì)胞為特異性CD8+細(xì)胞，并以占總計(jì)數(shù)CD8+細(xì)胞的百分比表示。HBV特異性CTLs陽性細(xì)胞定義為HBV特異性CTLs占總CD8+T細(xì)胞比率大于0.02%。

3.3 細(xì)胞刺激劑細(xì)胞內(nèi)因子染色 新鮮分離的PBMC鋪于48孔板中，每孔1 mL，細(xì)胞濃度3×109cells/L，加入 PMA 25 μg/L、ionomycin 1 mg/L 及monensin 2 mmol/L，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，收集細(xì)胞先行細(xì)胞表面 anti－CD3－FITC、anti－CD8－APC－Cy7、anti－PD －1－ PE －Cy7、anti－CD244－APC及同型染色，洗滌后固定，破膜后加入anti－IFN－γ－Brilliant Violet 421及同型抗體，室溫避光孵育20 min，破膜液洗滌1次后，PBS再次洗滌后重懸，備上機(jī)檢測。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.2流式分析軟件分析，用GraphPad Prism 5 Demo統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間非參數(shù)比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)，多組間非參數(shù)比較采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunns檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。設(shè)雙尾檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CHB患者PBMC及HBV特異性CTLs表面CD244和PD－1的表達(dá)模式

CHB患者HBV特異性CTLs陽性細(xì)胞較健康對照組明顯升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1A。PBMC表面CD244的表達(dá)在IT組及m－CHB組下調(diào)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1B;PBMC表面PD－1的表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1C。HBV特異性 CTLs表面CD244或PD－1單獨(dú)表達(dá)比在PBMC上表達(dá)明顯增加(75.49% ± 14.37%vs 32.48% ± 15.09%，P ＜0.01;87.27% ±12.69%vs 23.45% ±8.58%，P ＜0.01)，但CHB不同臨床類型的特異性CTLs表面CD244或PD－1的單獨(dú)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)，見圖 1D、E。

2 CD244與PD－1的共表達(dá)模式與CHB疾病進(jìn)程的相關(guān)性

外周血PBMC上CD244與PD－1的共表達(dá)在ACLF、s－CHB、m －CHB、IT及健康對照5組間存在顯著差異(P＜0.01)，見圖2A;在CHB不同臨床類型中，隨病情進(jìn)展，CD244與PD－1在HBV特異性CTLs上共表達(dá)有上調(diào)趨勢，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖2B。

3 CD244和PD－1表達(dá)與IFN－γ水平間的關(guān)系，以及與CHB疾病進(jìn)程的相關(guān)性

CD244或PD－1單陽性HBV特異性 CTLs和CD244與PD－1雙陽性HBV特異性CTLs分泌IFN－γ水平在CHB不同臨床類型間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見圖3A～C。進(jìn)一步相關(guān)分析顯示CD244或PD－1單陽性HBV特異性CTLs分泌IFN－γ能力與該單陽性細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r= －0.2942，P ＜0.05;r= －0.3901，P ＜0.01)，見圖3D、E;PD－1和CD244雙陽性的HBV特異性CTLs分泌IFN－γ能力與該細(xì)胞比例亦呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r= －0.5409，P ＜0.01)，見圖3F。

Figure1.Expression of CD244 and PD－1 on total and virus－specific CTLs in IT patients(n=7)，m－CHB patients(n=34)，s－CHB patients(n=20)，ACLF patients(n=20)and HC(n=14).A:the percentage of CD8+Pent+T －cells;B，C:the distribution of total CD244 and PD－1 expression among different groups;D，E:the distribution of CD244 and PD －1 expression on virus－specific CTLs among different groups;F～H:representative Zebra plots of Pent+CD8+T－cells，CD244+Pent+CD8+T－cells and PD－1+Pent+CD8+T－cells，respectively.Example graphs show events after gating on CD3+CD8+populations.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01.圖1 CHB不同臨床類型患者PBMC和HBV特異性CTLs表面CD244與PD－1的表達(dá)

討 論

Figure2.Co－expression of CD244 and PD－1 on CD8+T－cells(A)and Pent+CD8+T－cells(B)in CHB patients.Example graphs show events of CD244+PD－1+cells after gating on CD3+CD8+T－cell(C)and CD3+Pent+CD8+T－cell populations(D).*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.圖2 CHB不同臨床類型患者PBMC和HBV特異性CTLs表面CD244與PD－1共表達(dá)水平的比較

目前研究認(rèn)為HBV感染慢性化的關(guān)鍵因素是HBV持續(xù)存在導(dǎo)致細(xì)胞免疫(主要是HBV特異性CTLs)功能低下[4－5]。探討 HBV 特異性 CTLs功能低下的免疫病理機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能低下的原因除了缺乏CD4+T細(xì)胞輔助作用[10]、調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞功能活化[11－12]及 IL －10[13－14]等免疫調(diào)節(jié)因子的過度表達(dá)外，CD8+T細(xì)胞表面負(fù)性共刺激信號分子的過度表達(dá)也發(fā)揮了重要影響。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在慢病毒感染機(jī)體中，抗原特異性T淋巴細(xì)胞上高表達(dá)PD－1，伴隨細(xì)胞增殖及分泌功能的降低[4]。用抗PD－L1/2抗體阻斷PD－1信號通路，可恢復(fù)耗竭T細(xì)胞的增殖及分泌能力，利于病毒清除[5]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)PD－1與其它免疫抑制分子共表達(dá)在CD8+T細(xì)胞功能耗竭中發(fā)揮著協(xié)同作用，如PD－1與T細(xì)胞免疫球蛋白3(T －cell immunoglobulin －3，Tim －3)[15]、PD －1與淋巴細(xì)胞激活基因3(lymphocyte activation gene－3，LAG-3)[16]、PD-1 與 CD160、2B4[17]等。CD244，也叫做2B4，屬于淋巴細(xì)胞活化信號分子(signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)家族成員之一，組成性表達(dá)于NK細(xì)胞上，起始作為NK細(xì)胞活化分子而被大家熟知[18]。2B4還可以表達(dá)于CD8+T細(xì)胞、粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等細(xì)胞上[19]，其受體為CD48，后者表達(dá)于大部分的造血細(xì)胞上[20]。文獻(xiàn)報(bào)道，CD244活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴NK細(xì)胞或者T細(xì)胞上含免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine－based activation motif，ITAM)的 NKp46 或者TCR受體復(fù)合物[21]。故而CD244需在第一信號的刺激下，作為共刺激信號分子與配體CD48交聯(lián)后，在胞內(nèi)第二信號的輔助下向下游傳遞活化或抑制信號[22]。近年來有研究者在慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)[6]感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)2B4有免疫抑制的功能，可加重CD8+T細(xì)胞功能耗竭。陸續(xù)在有關(guān)HBV[7]、HCV[8]、HIV 等[23]的慢性感染研究中也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象。研究者認(rèn)為CD244分子交聯(lián)后傳遞活化或者抑制信號依賴于以下幾點(diǎn):(1)CD244分子的表達(dá)密度，若低、中度表達(dá)傳遞活化信號，若為高表達(dá)則傳遞抑制信號;(2)與其它抑制分子如PD－1等的共表達(dá)情況;(3)胞內(nèi)SLAM相關(guān)蛋白(SLAM－associated protein，SAP)的多少。

我們的研究利用五聚體技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)檢測CHB不同臨床類型患者外周血HBV特異性CTLs的比例及其表面負(fù)性共刺激信號分子CD244與PD－1的表達(dá)差異，結(jié)果顯示類似PD－1變化趨勢，CD244在HBV特異性CTLs上表達(dá)較其在PBMC上表達(dá)明顯升高，特異性CTLs表面CD244表達(dá)越高，該細(xì)胞分泌IFN－γ能力越弱，這與國外其它研究結(jié)果一致。這提示CD244表達(dá)上調(diào)與HBV特異性CTLs功能低下相關(guān)。另外，我們的研究顯示在CHB患者體內(nèi)，HBV特異性CTLs表面CD244和PD－1共表達(dá)明顯上調(diào)，并伴有CD244和PD－1雙陽性的特異性CTLs分泌IFN－γ功能的下降。這說明在HBV持續(xù)感染患者體內(nèi)，CD244與 PD－1在 HBV特異性CTLs表面共表達(dá)，可抑制該細(xì)胞的分泌功能，提示CD244可能協(xié)同PD－1抑制T細(xì)胞功能，共同導(dǎo)致HBV感染慢性化。

Figure3.The distribution of IFN－γ released by CD244+Pent+CD8+T－cells(A)，PD－1+Pent+CD8+T－cells(B)，CD244+PD－1+Pent+CD8+T－cells(C)in IT patients(n=7)，m－CHB patients(n=31)，s－CHB patients(n=20)，ACLF patients(n=18).D～F:corrlation of the percentage of the upper mentioned T－cells with IFN－γ released by themselves，respectively.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01.圖3 CHB不同臨床類型患者CD244和PD－1單陽性或者雙陽性的HBV特異性CTLs分泌IFN－γ水平的比較

另外，在慢性HBV感染的不同臨床類型之間，HBV特異性CTLs表面CD244或PD－1單獨(dú)表達(dá)水平無明顯差異。這說明CD244或PD－1單獨(dú)表達(dá)與CHB病程進(jìn)展無直接相關(guān)性，與我們之前有關(guān)PD－1的研究結(jié)果一致[24]。但 CHB中、重度組 HBV特異性CTLs比例及其表面CD244和PD－1共表達(dá)水平較免疫耐受組明顯升高，伴有CD244和PD－1雙陽性的特異性CTLs分泌IFN－γ功能的下降;當(dāng)病情惡化進(jìn)展至ACLF，CD244和PD－1共表達(dá)水平下降，而該細(xì)胞分泌IFN－γ的能力得以恢復(fù)。這提示CD244與PD－1可能存在不重疊的免疫抑制作用，兩者共表達(dá)上調(diào)可加重T細(xì)胞功能耗竭，并可能對疾病的進(jìn)展有更好的預(yù)示作用。研究表明，HBV感染機(jī)體后，若出現(xiàn)HBV特異性CTLs上高表達(dá)PD－1，則機(jī)體控制炎癥活動(dòng)，利于疾病恢復(fù);但若PD－1延遲表達(dá)或低水平表達(dá)，則易發(fā)展為急性肝衰竭[25]。我們推測，誘因激活CHB患者免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞在清除病毒的同時(shí)損傷肝細(xì)胞，炎癥因子增加，機(jī)體免疫自穩(wěn)激活，誘導(dǎo)HBV特異性CTLs細(xì)胞上高表達(dá)CD244、PD－1等抑制分子，從而抑制效應(yīng)細(xì)胞過度活化所造成的機(jī)體損傷，但若該分子表達(dá)量不足以抑制效應(yīng)細(xì)胞功能或過遲表達(dá)則可能會(huì)使機(jī)體自穩(wěn)調(diào)節(jié)減弱或者失敗，最終導(dǎo)致病情惡化并進(jìn)展至肝衰，甚至死亡;但若過早，過強(qiáng)，則會(huì)抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致病毒持續(xù)存在。因而CD244、PD－1等抑制分子在CHB患者體內(nèi)上調(diào)表達(dá)與在急性乙型肝炎患者體內(nèi)有著同樣的作用，即可抑制效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，減少對肝細(xì)胞的殺傷，倘若其表達(dá)延遲或者過低，則疾病易演變?yōu)锳CLF。HBV特異性CTLs表面CD244和PD－1共表達(dá)模式與CHB疾病進(jìn)程相關(guān)這一推測，我們需要進(jìn)一步隨訪觀察疾病不同進(jìn)展情況下的HBV特異性CTLs表面CD244、PD－1的表達(dá)情況與細(xì)胞功能變化來證實(shí)。

總之，本研究顯示CD244在CHB患者外周血HBV特異性CTLs上高表達(dá)，并協(xié)同PD－1發(fā)揮著免疫抑制效應(yīng)，提示CD244可能與CHB患者HBV特異性CTLs功能低下及CHB疾病進(jìn)展相關(guān)。

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