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    應(yīng)用亞硫酸鈉快速制備低氧性肺血管收縮離體模型所需低氧性Krebs-Henseleit液的方法及評(píng)價(jià)*

    2012-11-07 06:02:36姚海霞王淑君王良榮林麗娜王萬(wàn)鐵
    中國(guó)病理生理雜志 2012年12期
    關(guān)鍵詞:亞硫酸鈉離體溶解氧

    姚海霞, 祝 卿, 吉 偉, 王淑君, 王良榮, 林麗娜△, 王萬(wàn)鐵△

    (溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院麻醉科,2病理生理學(xué)教研室,浙江溫州325035)

    在研究急性低氧對(duì)肺血管張力影響的實(shí)驗(yàn)中,如何使肺血管環(huán)迅速獲得穩(wěn)定的低氧環(huán)境是研究前提。以往,低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV)研究多采用物理性低氧通氣法降低血管緩沖液Krebs-Henseleit(KH)液的氧分壓(oxygen partial pressure,PO2),雖然此方法可對(duì)肺血管造成低氧相關(guān)性損傷,但卻必須配備裝有高精準(zhǔn)比例的氮?dú)夂投趸嫉膬?chǔ)氣瓶[1],才能使血管KH液的PO2下降,而且在通入低氧氣體時(shí)要給浴槽加蓋保持密閉持續(xù)通氣很長(zhǎng)時(shí)間,這種密閉環(huán)境在掛著血管環(huán)的狀態(tài)下非常不易操作,而且通入氣體的時(shí)間和KH液的PO2無法精準(zhǔn)監(jiān)測(cè),不能保證每次實(shí)驗(yàn)達(dá)到的低氧條件都是一致。因此快速制備出HPV離體血管實(shí)驗(yàn)所需的穩(wěn)定的低氧性KH液具有重要意義。亞硫酸鈉(sodium sulfite,Na2SO3)作為一種主要的食品防腐劑,可快速去氧引發(fā)厭氧條件,從而有效地抑制好氧微生物的生長(zhǎng),且缺氧的程度和Na2SO3溶液的保質(zhì)期容易控制[2-4]。本研究擬在暴露空氣的開放環(huán)境中將無水Na2SO3加至0.5 L KH液中,利用Na2SO3結(jié)合水溶液中溶解氧的能力,以期獲得一種快速制備低氧性KH液的新方法,應(yīng)用于肺血管急性低氧實(shí)驗(yàn)的離體研究。

    材料和方法

    1 材料

    便攜式臨床分析儀 (型號(hào):2-35451,i-STAT Corporation);pH計(jì)(型號(hào):滬制01040055,梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電熱恒溫水浴鍋(型號(hào):HH.521-4-5,上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);溫度計(jì);無水Na2SO3;KH液:0.5 L KH 液含 NaCl 3.2409 g,KCl 0.1752 g,MgSO40.1479 g ,NaHCO31.0501 g,KH2PO40.0816 g ,CaCl20.1387 g ,葡萄糖0.9000 g(上述試劑均為市售分析純級(jí))。

    2 方法

    2.1 選用8份雙蒸水配置0.5 L KH液(溫度:37℃,pH 7.30~7.45)。在暴露空氣的開放環(huán)境下,分別加入0(A1,對(duì)照組)、0.2(A2)、0.5(A3)、0.8(A4)、1.1(A5)、1.4(A6)、1.5(A7)、1.6 g(A8)的無水 Na2SO3攪拌充分溶解后,1 mol/L HCl調(diào)定 pH 7.30 ~7.45,二氧化碳分壓(carbon dioxide partial pressure,PCO2)35~45 mmHg。分別在加樣后1 min取樣行成分分析,選擇符合低氧條件(PO2降低到40 mmHg以下)的Na2SO3-KH液進(jìn)入以下研究。

    2.2 根據(jù)加樣后1 min液體指標(biāo)測(cè)定,選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液,充分溶解后,分別在加樣前和加樣后1、10、20、30、60、90 min 取樣行成分分析(pH、PCO2、PO2及 Na+濃度)。每次測(cè)定前先測(cè)定溶液pH,如pH超出范圍,先用HCl調(diào)節(jié)再測(cè)定各指標(biāo)。另外,由于Na2SO3進(jìn)入水中反應(yīng)生成等 mol的Na2SO4,含2倍mol的Na+,明顯增加KH液Na+濃度,為了防止溶液出現(xiàn)高滲,經(jīng)過換算把增加的Na+通過減少NaCl的量使Na+滲透壓保持在135~155 mmol/L,本實(shí)驗(yàn)把0.5 L KH液中加入的NaCl的劑量改為2.0563 g,其余成分的劑量不變。

    2.3 根據(jù)上述方法,選擇1.5 g Na2SO3加至0.5 L KH液,充分溶解后,分別在加樣前和加樣后 0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、、21 h、24 h 取樣進(jìn)行成分分析(pH、PCO2和PO2),觀察低氧溶液24 h的變化。

    2.4 方法同 2.2,選擇 1.5 g Na2SO3加至 0.5 L KH 液,充分溶解后,分別在加樣前和加樣后第1 d、第2 d、第3 d、第4 d、第 5 d、第6 d、第7 d、第8 d、第 9 d、第10 d、第11 d 取樣進(jìn)行成分分析(pH、PCO2和PO2),觀察低氧溶液的維持狀態(tài)。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同劑量的Na2SO3對(duì)0.5 L KH液PO2的影響

    各組0.5 L KH液中加不同劑量Na2SO31 min后,與對(duì)照組(A1)相比,溶液PO2降低(P<0.01),且隨著Na2SO3劑量的增加,PO2降低明顯(P<0.01),pH和PCO2改變無顯著差異(P>0.05)。其中A7組PO2均處于20~40 mmHg范圍,最適合HPV離體模型實(shí)驗(yàn)所需,見表1。

    表1 溶入不同劑量Na2SO31 min后0.5 L KH液中pH、PCO2和PO2的變化Table 1.The values of pH,carbon dioxide partial pressure(PCO2),oxygen partial pressure(PO2)after different doses of sodium sulfite(Na2SO3)dissolved in Krebs-Henseleit(KH)solution at 1 min(ˉx±s.n=8)

    2 應(yīng)用1.5 g Na2SO3可使0.5 L KH溶液達(dá)到HPV所需的低氧性溶液并且可維持低氧狀態(tài)至少90 min

    將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH 液后PO2由(150.00 ±17.25)mmHg迅速降到(24.75 ±2.87)mmHg,加樣后20、30、60 min與1 min相比PO2改變未見顯著差異(P>0.05),而10 min與1 min相比PO2降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且90 min時(shí) PO2為(27.50±1.41)mmHg,與 1 min時(shí)相比有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但二者PO2數(shù)值仍處于20~40 mmHg范圍內(nèi)。各時(shí)點(diǎn)的PCO2多處于正常范圍(35~45 mmHg);pH處于正常范圍(7.30~7.45);Na+滲透壓均處于正常范圍(135~155 mmol/L),見表2。此低氧條件已滿足急性HPV離體實(shí)驗(yàn)所需的低氧狀態(tài)的維持時(shí)間60 min。

    3 應(yīng)用1.5 g Na2SO3達(dá)到的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化

    將1.5 g Na2SO3加入到0.5 L KH液后,加樣后各時(shí)點(diǎn)與1 min相比PO2和PCO2均無明顯變化(P>0.05),見圖1。

    4 應(yīng)用1.5 g Na2SO3的低氧溶液PO2在加樣后第2 d開始上升,在第11 d上升至正常

    將1.5g Na2SO3加入到0.5 L KH液后,第2 d之后的各時(shí)點(diǎn)與第1 d相比差異顯著(P<0.05),第11 d與未加樣前相比無顯著差異(P>0.05),見圖2。

    表2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后各時(shí)點(diǎn)的 pH、PCO2、PO2和 Na+濃度的變化Table 2.The values of pH,PCO2,PO2,the concentration of Na+after 1.5 g Na2SO3dissolved in KH at various time points(ˉx±s.n=8)

    Figure 1.Changes of PO2and PCO2after 1.5g Na2SO3dissolved in KH solution at various time points during the first day.ˉx±s.n=8.圖1 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH 液后第 1 d(24 h)內(nèi)各時(shí)點(diǎn)PO2和PCO2的變化

    Figure 2.Daily changes of PO2and PCO2after 1.5 g Na2SO3 dissolved in KH solution.ˉx±s.n=8.*P<0.05 vs 1 d.圖2 1.5 g Na2SO3溶入0.5 L KH液后每天PO2和PCO2的變化

    討 論

    HPV是近年研究熱點(diǎn),常見于當(dāng)肺泡氧分壓降到某一臨界值,肺血管發(fā)生快速、可逆的收縮反應(yīng),以糾正肺泡通氣/灌流的不匹配,從而在不明顯改變肺動(dòng)脈壓的情況下最大程度地提高機(jī)體氧分壓。短時(shí)間內(nèi)的HPV對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)機(jī)制,但長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作HPV卻是肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病的“元兇”,研究HPV機(jī)制對(duì)肺動(dòng)脈高壓和肺心病以及慢性阻塞性肺疾病等防治機(jī)制的基礎(chǔ)研究有重要意義。在離體肺血管實(shí)驗(yàn)中,如何快速有效地制備離體低氧模型所需的低氧性KH液是研究HPV的前提條件。目前多將離體肺血管置于低氧環(huán)境中,其基本實(shí)驗(yàn)條件為:PO220~40 mmHg,PCO235~45 mmHg,pH 7.30 ~7.45。常用造模方法為物理性低氧法,即肺血管環(huán)平衡穩(wěn)定后向器官浴槽中通入的常氧氣體(95%O2和5%CO2)轉(zhuǎn)換為無氧氣體(95%N2和5%CO2),并且要浴槽口加蓋密封使浴槽中KH液PO2達(dá)到(40±10)mmHg。此方法不足之處首先是實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)換氣體條件時(shí)常出現(xiàn)時(shí)間和氣壓不同步,并且浴槽中KH液的PO2、PCO2和pH在各個(gè)時(shí)點(diǎn)無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),不能控制PO2降低的程度,PO2達(dá)到要求的時(shí)點(diǎn)和氣體的流速不好把握,即使PO2達(dá)到要求,并不能完全保證PCO2在正常范圍內(nèi)。其次,當(dāng)達(dá)到所需要的低氧條件后,如果要進(jìn)行后期的藥物干預(yù)須經(jīng)浴槽口直接加藥物的話就不可避免地破壞密閉環(huán)境,大氣壓氧的影響使降低的PO2極易變化而不穩(wěn)定,影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

    Abudara等[5]和胡清華等[6]使用硫代硫酸鈉剝奪水溶液中的氧模擬低氧反應(yīng),類似于物理性低氧。然而,硫代硫酸鈉容易自燃,它與水反應(yīng)是放熱反應(yīng),反應(yīng)后生成Na2SO3和二氧化硫(SO2)。也有研究用氯化鈷與鐵(氧傳感途徑的重要因子)競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制制作化學(xué)性缺氧模型,但是氯化鈷是一種重金屬具有組織和細(xì)胞毒性[7]。研究報(bào)道[8]Na2SO3可以降低水溶液中的溶解氧濃度,并且能激活缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)控途徑,表明Na2SO3是一種潛在的可模擬低氧應(yīng)激的刺激物[2]。并且 Na2SO3和水的反應(yīng)不自燃,也不產(chǎn)生 SO2,Na2SO3進(jìn)入水溶液中與氧反應(yīng)生成的硫酸鈉(Na2SO4)對(duì)機(jī)體的危害與低氧相比幾乎是沒有毒性的。因此Na2SO3相比硫代硫酸鈉更有優(yōu)勢(shì)[2]。

    本研究結(jié)果表明,在開放環(huán)境中,不同劑量Na2SO3可使0.5 L KH液PO2降低,并呈劑量依賴性,即溶液中Na2SO3的量越大,PO2就越低。從表1中可見尤其是加1.5 g Na2SO3可使PO2降低到40 mmHg以下,這個(gè)條件符合于離體肺血管低氧實(shí)驗(yàn)的研究條件。且1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液暴露在空氣中90 min,發(fā)現(xiàn)PO2基本穩(wěn)定,而溶液pH值、PCO2和Na+滲透壓無明顯變化。這與完全去除溶解在1 L水中的溶解氧需要0.08 g Na2SO3[8]的理論相吻合,因?yàn)榇髿庋鯐?huì)逐漸地再溶解于水溶液中,低濃度的Na2SO3不可能完全去除水溶液中的溶解氧,按照前述的理論換算,0.5 L KH中加入的1.5 g Na2SO3中,其中0.04 g是用于去除水中的溶解氧,剩余的1.46 g是用于抑制大氣壓氧的再溶解從而保證其低氧狀態(tài)(20~40 mmHg)維持一定時(shí)間段。就這一點(diǎn)說,Na2SO3達(dá)到的低氧狀態(tài)在可控性和穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢(shì);而且離體血管處于開放的環(huán)境,無需將浴槽加蓋,便于用一些特殊的儀器和試劑對(duì)血管進(jìn)行干預(yù)并作及時(shí)的觀察。因此,1.5 g Na2SO3加入0.5L KH液中充分溶解后,可滿足急性低氧性肺血管實(shí)驗(yàn)所需的低氧條件,并且維持此低氧狀態(tài)最少90 min,足以達(dá)到肺血管實(shí)驗(yàn)的急性低氧時(shí)間1 h。

    此外,本研究結(jié)果3和4發(fā)現(xiàn),1.5 g Na2SO3-KH低氧溶液的低氧狀態(tài)在24 h內(nèi)無變化,在第2 d PO2開始上升,在第11 d上升至正常值,低氧狀態(tài)最多可以維持24 h,足以達(dá)到HPV離體實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷募毙缘脱鯐r(shí)間1 h.

    Jiang等[4]最新研究得出結(jié)論:Na2SO3能降低M9緩沖液中的溶解氧,是一種模擬低氧應(yīng)激的潛在因子,其誘發(fā)的低氧環(huán)境建造的線蟲低氧模型和物理性低氧模型一致,證明Na2SO3可以用于建造低氧實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷难芯?,但并未具體驗(yàn)證Na2SO3是否可以用于血管、細(xì)胞或其它靶組織低氧實(shí)驗(yàn)的研究。因?yàn)檠?、?xì)胞等離體器官的實(shí)驗(yàn)其各自的緩沖液各不相同,如離體血管的緩沖液是 KH,離體細(xì)胞的培養(yǎng)液是DMEM液,線蟲的緩沖液則為M9緩沖液。各自緩沖液的成分比例差別很大。Jiang等[4]研究的Na2SO3降低M9緩沖液的氧程度和維持能力不一定與KH液和DMEM液相同,也許會(huì)因?yàn)槌煞值牟煌ハ嘤绊懚l(fā)生變化。因此Na2SO3是否可以用于制備血管或細(xì)胞的缺氧模型仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此,本研究是在Jiang等[4]的研究基礎(chǔ)上具體探索了Na2SO3是否可以用于制備低氧性肺血管收縮實(shí)驗(yàn)所需的低氧性KH液的可行性,并進(jìn)一步支持了Jiang等[4]的研究結(jié)果。本研究結(jié)果為開展Na2SO3在其它血管如主動(dòng)脈血管或腸系膜血管或細(xì)胞等靶器官低氧研究中的應(yīng)用提供了可能的依據(jù),從而為解決低氧研究提供新方法和解決途徑。本研究測(cè)定的指標(biāo)除PO2外,還觀察了低氧溶液的pH值、PCO2和Na+滲透壓,保證了肺血管處于一個(gè)穩(wěn)定的低氧性環(huán)境。此外,本方法造價(jià)低廉,制作簡(jiǎn)單,使用方便,為低氧實(shí)驗(yàn)的研究提供了一種新手段。

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