翅果油樹(shù)葉片中三萜皂苷的提取工藝研究

張曉俊，閆桂琴

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性研究所，山西 臨汾 041004)

翅果油樹(shù)(Elaea gnus．mollis．Diels)屬胡頹子科胡頹子屬植物，是第四紀(jì)冰川作用后殘存下來(lái)的古生植物，為我國(guó)特有種，國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物［1］。主要分布于山西省鄉(xiāng)寧、翼城、平陸等地的低山、丘陵區(qū)和陜西秦嶺北麓的戶縣。翅果油樹(shù)葉片中富含各種營(yíng)養(yǎng)成分，是一種優(yōu)良的野生植物資源，具有重要的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用價(jià)值。

三萜皂苷在自然界分布很廣，并且具有廣泛的藥理作用和生物活性，如免疫作用、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、防治心血管疾病等，而且還可以作為食品天然甜味劑、保護(hù)劑、發(fā)泡劑、增味劑、抗氧化劑等。目前，三萜皂苷已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物和食品方面［2］。

本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)考查了浸提法提取翅果油樹(shù)葉片中三萜皂苷的主要影響因素，研究了最佳提取工藝條件，期望探索一種快速、簡(jiǎn)便、提取率高的提取方法。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2010年9月于山西翼城甘泉林場(chǎng)采集翅果油樹(shù)葉片，洗凈放置于40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，經(jīng)研磨粉碎后過(guò)0.177 mm(80目)篩備用。

1.2 儀器和藥品

1.2.1 主要儀器及設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)FW100(天津市泰斯儀器有限公司)，電子天平 FA1104(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)，D GH-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，UV-401PC紫外分光光度計(jì)(日本島津)。

1.2.2 主要化學(xué)及生化試劑

無(wú)水乙醇，正丁醇，香草醛，濃硫酸(均為分析純)。

77%硫酸溶液:準(zhǔn)確量取蒸餾水21 mL于400 mL燒杯中，緩慢加入98%硫酸溶液79 mL，靜置后倒入容量瓶中，低溫保存。

8%香草醛-無(wú)水乙醇溶液:準(zhǔn)確稱取香草醛8 g于50 mL燒杯中，加無(wú)水乙醇溶解，定容至100 mL，置于棕色瓶中，低溫保存。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備(100 μg·mL－1):準(zhǔn)確稱取薄層層析得到的三萜皂苷0.025 g，置于100 mL燒杯中，加甲醇使之溶解，定容至250 mL，搖勻密塞，低溫保存。

1.3 方法

稱取2.0 g翅果油樹(shù)葉片粉末，用無(wú)水乙醇溶液浸提，將提取液進(jìn)行抽濾，濃縮至浸膏狀，加入25 mL蒸餾水復(fù)溶，抽濾，濾液再加入正丁醇進(jìn)行萃取，萃取至正丁醇層無(wú)色為止，合并正丁醇層，濃縮至干。采用香草醛－濃硫酸顯色法測(cè)定含量并計(jì)算提取率［3］。

提取率/%=三萜皂苷的質(zhì)量/翅果油樹(shù)葉片粉末的質(zhì)量 ×100。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取 100 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 mL，于容量瓶中定容到50 mL，分別取2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00 mL于具塞試管中，烘干溶液，加入8%香草醛-無(wú)水乙醇液 0.5 mL，1 min后，加入77%硫酸3 mL，搖勻，在75℃恒溫水浴中加熱5 min，冰水浴15 min，移取1 mL于比色管中加入77%硫酸定容到10 mL，搖勻，10 min后采用紫外分光光度計(jì)在440 nm處(比色皿厚度為10 mm)測(cè)定吸光值。以試劑空白為參比液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別加入30%，45%，60%，75%，90%等濃度不同的乙醇溶液浸提，按1.3的方法得到不同濃度提取劑對(duì)提取率的影響。

1.3.3 溫度對(duì)提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃不同溫度下浸提，按

1.3 的方法得到不同提取溫度對(duì)提取率的影響。

1.3.4 料液比對(duì)提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別用1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 不同的料液比浸提，按 1.3的方法得到不同料液比對(duì)提取率的影響。

1.3.5 時(shí)間對(duì)提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各 3份，分別選擇30，60，90，120，150 min不同時(shí)間浸提，按1.3的方法得到不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)選擇L9(34)正交表，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間為4因素，做3水平的正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

翅果油樹(shù)葉片提取物待測(cè)液在波長(zhǎng)200～600 nm區(qū)間吸光值不明顯，而經(jīng)香草醛－濃硫酸顯色后有強(qiáng)的吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)為440 nm，在此位置有明顯的峰形，與標(biāo)準(zhǔn)品溶液顯色后的掃描曲線相似，本法選用440 nm為測(cè)定波長(zhǎng)［4］。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從圖1可以得出以吸光度對(duì)三萜皂苷含量求的回歸方程是:y=0.103x+0.048 7，相關(guān)系數(shù) r=0.996 4。

2.3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，溶液的極性增強(qiáng)，提取率也在增加。乙醇濃度75%時(shí)提取率最大，但濃度繼續(xù)增加反而會(huì)使提取率下降。這主要是由于隨著乙醇-水體積分?jǐn)?shù)的變化，溶劑的極性發(fā)生變化，使一些醇溶性雜質(zhì)、色素等有機(jī)成分溶出量增加。根據(jù)相似相溶原理，乙醇濃度達(dá)到一定程度時(shí)，提取率會(huì)下降［5］。

圖1 三萜皂苷含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.4 提取溫度對(duì)提取效果的影響

從圖3中可以看出，隨著溫度的增加，三萜皂苷溶解度不斷增加，但當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，提取率反而下降?？赡苁怯捎跍囟冗^(guò)高超過(guò)溶劑沸點(diǎn)后，容易造成溶劑的損失，使提取率下降;同時(shí)溫度過(guò)高，雜質(zhì)的溶出量增加，導(dǎo)致提取率下降［6］。

圖3 溫度對(duì)提取率的影響

2.5 料液比對(duì)提取效果的影響

由圖4知，提取率隨乙醇提取劑用量的增加而升高，整個(gè)曲線呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶25后，增加的幅度較小。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響

2.6 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間增加，提取率也在增加。當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)90 min后，提取率下降。這是因?yàn)榻釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得部分不穩(wěn)定的皂苷結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，其他大量非皂苷類的成分也在溶出，可能會(huì)結(jié)合部分皂苷沉淀［7－10］。

圖5 時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.7 正交試驗(yàn)

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(表1)分析可知，在4個(gè)因素中，影響翅果油樹(shù)葉片中三萜皂苷提取效果的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，提取率最高的條件為A2B3C2D3，即乙醇濃度60%，溫度70℃，料液比1∶20，提取時(shí)間 120 min。

表1 各處理組合對(duì)提取率的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇作為提取溶劑是因?yàn)榇继岱梢詼p少藥材中水溶性雜質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和粘液質(zhì)的浸出，避免三萜皂苷在水溶液中會(huì)起泡沫，這樣會(huì)有定量上的誤差。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在醇類提取劑中，甲醇的提取率高于乙醇，但甲醇毒性大，且乙醇提取液不會(huì)發(fā)霉變質(zhì)，容易回收利用。因此，綜合各方面因素，采用醇提法，選擇乙醇為提取溶劑。

盡管傳統(tǒng)提取法目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用普遍，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑損耗多等缺點(diǎn)［10－16］。在傳統(tǒng)提取基礎(chǔ)上采用超聲波或微波等現(xiàn)代輔助提取技術(shù)，雖然能有效提高提取率，縮短時(shí)間，降低耗能等，但這些技術(shù)尚未能在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模使用，考慮到本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的情況，本實(shí)驗(yàn)選擇浸提法來(lái)進(jìn)行研究。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以乙醇作為提取溶劑，采用浸提法，研究了影響翅果油樹(shù)葉片中三萜皂苷提取率的因素。選擇乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比，分別作了單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，用正交實(shí)驗(yàn)確定了提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度60%，溫度70℃，料液比1∶20，提取時(shí)間120 min時(shí)提取率最高。

［1］王晶利，李君．中藥有效成分提取方法研究進(jìn)展田［J］．陜西中醫(yī)函授，1995(3):23－25．

［2］王曉穎，劉大有，夏忠庭，等．三萜皂苷定性定量分析方法研究進(jìn)展［J］．中草藥，2002，33(9):861－863．

［3］黃河寧，賴文忠，周文富，等．分光光度法測(cè)定茶制品中兒茶素含量的研究［J］．紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，23(9):25－27．

［4］劉淼．中草藥成分提取分離與制劑加工新技術(shù)新工藝新標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用手冊(cè)［M］．北京:中國(guó)教育出社，2004:315．

［5］石建輝，王金輝，車東，等．核桃楸樹(shù)皮化學(xué)成分研究［J］．中藥研究與信息，2005，7(1):7－8．

［6］曾里，曾凡俊，張杰，等．超聲波技術(shù)應(yīng)用于元寶楓黃酮浸提的研究［J］．食品科技，2008(1):163－166．

［7］魏敏，江雪華．正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃茂提取工藝研究［J］．基層中藥雜志，2000，14(6):23－25．

［8］黎海彬，張敏，王邕，等．植物三萜皂苷的提取分離技術(shù)［J］．食品工業(yè)科技，2006，27(1):201－204．

［9］李敏，費(fèi)曜，李麗霞，等．天冬中總皂苷含量測(cè)定方法的探討［J］．成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(4):46－48．

［10］吳洪蘭，李奎平，孟祥學(xué)，等．分光光度法測(cè)定人參花蕾中總皂苷的含量［J］．時(shí)珍國(guó)藥研究，1998，9(2):140．

［11］張亞．皂苷類成分的生物樣品測(cè)定方法5年來(lái)研究狀況［J］．醫(yī)學(xué)信息，2005，18(6):677－679．

［12］孫光芝，王繼彥，劉志，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選人參中丙二?；藚⒃碥盏奶崛」に囇芯浚跩］．中草藥，2006，37(8):1194－1195．

［13］周琳，李元波，曾英．超聲酶法提取三七總皂苷的研究［J］．中成藥，2006，28(5):642－645．

［14］王曉娟，朱玲珍．牛膝皂苷的化學(xué)成分研究［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(6):427－430．

［15］斯建勇，陳迪華．羅漢果中三萜皂苷的分離和結(jié)構(gòu)鑒定［J］．植物學(xué)報(bào)，1996，38(6):489－499．

［16］婁紅祥，郎偉君．金銀花水溶性化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定［J］．中草藥，2006，27(4):195－199．