不同提取工藝翅果油抗氧化能力與活性成分的分析

張 忠，王呈馨，范柳萍，李 娟

(1.山西醫(yī)科大學(xué) 人體解剖教研室，太原 030001; 2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122; 3.山西琪爾康翅果生物制品有限公司，山西 臨汾 041000)

翅果油樹(ElaeagnusmollisDiels)是一種落葉喬木，屬胡頹子科、胡頹子屬，屬于國家二級瀕危保護(hù)植物[1]。翅果油樹主要分布在山西省的翼城、平陸和鄉(xiāng)寧等地，在陜西省也有零星分布[2]。翅果油中不飽和脂肪酸、VE、植物甾醇等營養(yǎng)成分含量豐富，具有抗氧化、降血脂等多種生理功能。陳雨娜[3]以昆明種小鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)翅果油可顯著提高小鼠血清及肝臟組織的抗氧化能力和血脂調(diào)節(jié)能力。黃玲等[4]發(fā)現(xiàn)翅果油在Wistar雄性大鼠體內(nèi)的抗氧化作用顯著強于同等劑量的純VE，也強于沙棘油。翅果油的抗氧化功能與其脂肪酸組成、有益伴隨物密切相關(guān)。國外有較多對不同植物油中有益微量伴隨物含量與抗氧化能力關(guān)系的報道。Antónia等[5]分析了橄欖果渣中VE、脂肪酸組成以及總酚含量，并對其抗氧化能力進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明羥基酪醇、α-生育酚和多不飽和脂肪酸都是橄欖果渣中重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。Behvar等[6]采用GC-MS檢測了薄荷精油中的各種有益伴隨物含量，并采用6種不同的方法檢測其抗氧化能力，結(jié)果表明薄荷精油具有強的自由基清除能力、金屬離子螯合能力和鐵離子還原力，可作為高效的抗氧化劑。

目前，翅果油的研究主要集中在翅果油的營養(yǎng)成分、制備工藝以及降血脂、抗炎、抗疲勞等功能方面，缺乏翅果油不同制油方法、不同細(xì)分部分的抗氧化活性以及抗氧化活性的基礎(chǔ)物質(zhì)的研究，為此本文深入分析了5種不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的抗氧化能力，并通過相關(guān)性分析初步研究了翅果油抗氧化能力與翅果油中生物活性成分含量之間的關(guān)系，明確其抗氧化活性的主要基礎(chǔ)物質(zhì)，以期為功能性翅果油的高質(zhì)量開發(fā)提供詳實的數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

翅果油樹種子，由山西琪爾康翅果生物制品有限公司提供。無水乙醇、氫氧化鉀等，均為分析純。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品、VE標(biāo)準(zhǔn)品、甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、維生素E水溶性類似物(Trolox)，均購于Sigma公司。

N-20多功能氮吹儀，CP214電子分析天平，CS-700Y型搖擺粉碎機(jī)，SC-30超級恒溫槽，CZR091型榨油機(jī)，SFE 500超臨界萃取設(shè)備，HPLC 2414液相色譜分析儀，GC-9A氣相色譜分析儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 翅果油的不同提取工藝

按以下5種工藝提取翅果油，之后將翅果油置于4℃冰箱中保存，用于生物活性成分和抗氧化活性的檢測。

1.2.1.1 超臨界CO2流體萃取法

將翅果油樹種子粉碎至80目，根據(jù)前期試驗[7]，稱取120 g翅果油樹種子粉置于萃取釜中，在萃取壓力30 MPa、萃取溫度50℃、萃取時間150 min的條件下進(jìn)行超臨界CO2流體萃取，獲得翅果油。

1.2.1.2 有機(jī)溶劑提取法

將翅果油樹種子粉碎至40目，取翅果油樹種子粉，參照前期試驗[7]和GB 5009.6—2016中的索氏提取法提取翅果油。以無水乙醚為提取溶劑，提取條件為料液比1∶10、提取溫度65℃、回流時間4 h，蒸干溶劑后得到翅果油。

1.2.1.3 直壓冷榨法

根據(jù)前期試驗[7]，稱取適量的翅果油樹種子，裝入濾袋置于榨油機(jī)中，在60 MPa下壓榨，收集得到翅果油。

1.2.1.4 直壓熱榨法

參考譚傳波等[8]提取山茶油的熱榨工藝，適當(dāng)調(diào)整后用于提取翅果油。稱取適量的翅果油樹種子于托盤中，在130℃鼓風(fēng)式烘箱中烘烤30 min，趁熱裝入濾袋置于榨油機(jī)中，在60 MPa下壓榨，收集得到翅果油。

1.2.1.5 紅外熱榨法

根據(jù)前期試驗[7]，稱取適量的翅果油樹種子于托盤中，在150℃遠(yuǎn)紅外烘箱中烘干1 h，趁熱裝入濾袋置于榨油機(jī)中，在60 MPa下壓榨，收集得到翅果油。

1.2.2 抗氧化活性的測定

參考劉國艷[9]的方法處理翅果油，分別制備翅果油的極性部分和非極性部分。

DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、Fe3+還原能力(吸光度)的測定及計算參照徐鑫等[10]的方法。

羥基自由基清除率的測定及計算參照張志英[11]的方法。

1.2.3 翅果油中生物活性成分的測定

1.2.3.1 甾醇含量的測定

以5α-膽甾烷醇為內(nèi)標(biāo)，采用GC-MS測定翅果油中的甾醇含量[12]。KOH-乙醇溶液處理油樣后用正己烷萃取，定容后進(jìn)行GC-MS分析。檢測條件： DB-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)，載氣流速 1.0 mL/min，分流比100∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，離子化模式EI，分子離子碎片掃描范圍(m/z)50～650。

1.2.3.2 VE含量的測定

用色譜純正己烷超聲溶解翅果油后，采用高效液相色譜分析測定VE含量。色譜條件：Luna Silica色譜柱(150 mm×4.6 mm×3 μm)，流動相為正己烷-異丙醇(體積比99∶1)，檢測波長290 nm。

1.2.3.3 角鯊烯含量的測定

參照張東生等[13]的方法測定翅果油的角鯊烯含量。KOH-乙醇溶液處理油樣后用正己烷萃取，定容后進(jìn)行GC分析。色譜條件： Rtx-1彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器溫度300℃，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比100∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅果油的抗氧化能力

2.1.1 翅果油DPPH自由基清除能力的比較

不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對DPPH自由基的清除率如圖1所示。

注：冷榨、有機(jī)、SFE、紅外和熱榨分別對應(yīng)直壓冷榨法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界CO2流體萃取法、紅外熱榨法和直壓熱榨法。下同。圖1 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對DPPH自由基的清除率

由圖1可見，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率也逐漸增加。在全油中，除直壓熱榨法外，其余4種提取工藝制得的翅果油質(zhì)量濃度為40 mg/mL時，DPPH自由基清除率已達(dá)90%。在翅果油極性部分中，除超臨界CO2流體萃取法外，其余4種提取工藝在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時，DPPH自由基清除率已達(dá)90%。在翅果油非極性部分中，5種提取工藝在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)到49%以上，且具有良好的線性關(guān)系。

根據(jù)DPPH自由基清除率的變化趨勢，比較5種提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分在同一質(zhì)量濃度(20.0 mg/mL)下DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對DPPH自由基的的清除能力

由圖2可見：在全油中，有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油DPPH自由基清除能力最強，為678.95 μmolTE/100 g；直壓熱榨法制得的翅果油DPPH自由基清除能力最弱，為245.22 μmolTE/100 g。在翅果油極性部分中，紅外熱榨法的DPPH自由基清除能力最強，為1 080.35 μmolTE/100 g；超臨界CO2流體萃取法的DPPH自由基清除能力最弱，為756.16 μmolTE/100 g。在翅果油非極性部分中，有機(jī)溶劑提取法的DPPH自由基清除能力最強，為130.81 μmolTE/100 g；直壓熱榨法的DPPH自由基清除能力最弱，為56.05 μmolTE/100 g。

2.1.2 翅果油羥基自由基清除能力的比較

不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對羥基自由基的清除率如圖3所示。

圖3 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對羥基自由基的清除率

由圖3可見，翅果油全油及其極性、非極性部分的羥基自由基清除率均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加逐漸升高。在同一質(zhì)量濃度下，5種提取工藝制得的翅果油全油及其極性和非極性部分的羥基自由基清除率相近。在全油中，當(dāng)翅果油質(zhì)量濃度為1～4 mg/mL時，除直壓冷榨法外，其他4種提取工藝下樣品質(zhì)量濃度與羥基自由基清除率具有良好的線性關(guān)系。5種提取工藝制得的翅果油極性部分在3.5 mg/mL時，羥基自由基清除率均達(dá)90%。5種提取工藝制得的翅果油非極性部分在3.0 mg/mL時，羥基自由基清除率均達(dá)90%。

在同一質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)下比較不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的羥基自由基清除能力，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見：在全油中，直壓冷榨法對羥基自由基的清除能力最強，為22 194.14 μmolTE/100 g；直壓熱榨法對羥基自由基的清除能力最弱，為11 723.36 μmolTE/100 g。在翅果油極性、非極性部分中，直壓冷榨法對羥基自由基的清除能力最強，分別為38 272.82、32 220.76 μmolTE/100 g。

圖4 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對羥基自由基的清除能力

2.1.3 翅果油ABTS自由基清除能力的比較

不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對ABTS自由基的清除率如圖5所示。

圖5 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對ABTS自由基的清除率

由圖5可見，不同提取工藝得到的翅果油對ABTS自由基的清除率均隨著翅果油質(zhì)量濃度的增大逐漸增加。在全油中，有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，對ABTS自由基清除效果最好，清除率可達(dá)90%以上。在翅果油極性部分中，當(dāng)質(zhì)量濃度為32 mg/mL時，除超臨界CO2流體萃取法和直壓熱榨法外，其余3種提取工藝制得的翅果油的極性部分對ABTS自由基清除率均達(dá)90%以上。在翅果油非極性部分中，在10～50 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，有機(jī)溶劑提取法的ABTS自由基清除率最高，50 mg/mL時為55%，遠(yuǎn)高于直壓熱榨法的。

在同一質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)下比較不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的ABTS自由基清除能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分對ABTS自由基的清除能力

由圖6可見：在全油中，有機(jī)溶劑提取法的翅果油對ABTS自由基的清除能力最強，為1 032.02 μmolTE/100 g，超臨界CO2流體萃取法的對ABTS自由基的清除能力最弱，為459.47 μmolTE/100 g；在翅果油非極性部分中，有機(jī)溶劑提取法的對ABTS自由基的清除能力最強，為525.37 μmolTE/100 g，直壓熱榨法的對ABTS自由基的清除能力最弱，為96.94 μmolTE/100 g；在翅果油極性部分中，有機(jī)溶劑提取法的對ABTS自由基的清除能力最強，為2 000.76 μmolTE/100 g，超臨界CO2流體萃取法的對ABTS自由基的清除能力最弱，為636.50 μmolTE/100 g。

2.1.4 翅果油Fe3+還原能力的比較

不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的Fe3+還原能力(吸光度)如圖7所示。

圖7 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的Fe3+還原能力(吸光度)

由圖7可見，在全油中，當(dāng)5種提取工藝制得的翅果油質(zhì)量濃度在60～100 mg/mL范圍內(nèi)時，有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油Fe3+還原能力最強。在翅果油極性部分中，當(dāng)質(zhì)量濃度在8～40 mg/mL范圍內(nèi)時，紅外熱榨法制得的翅果油Fe3+還原能力最強。在翅果油非極性部分中，當(dāng)質(zhì)量濃度在20～50 mg/mL范圍內(nèi)，有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油Fe3+還原能力最強。

在同一質(zhì)量濃度(20.0 mg/mL)下，比較不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的Fe3+還原能力，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同提取工藝制得的翅果油全油及其極性、非極性部分的Fe3+還原能力

由圖8可見：在全油中，有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油Fe3+還原能力最強，達(dá)937.66 μmolTE/100 g，直壓冷榨法制得的翅果油Fe3+還原能力最弱，為281.57 μmolTE/100 g；在翅果油非極性部分中，有機(jī)溶劑提取法的Fe3+還原能力最強，為313.06 μmolTE/100 g，紅外熱榨法的Fe3+還原能力最弱，為119.35 μmolTE/100 g；在翅果油極性部分中，紅外熱榨法的Fe3+還原能力最強，為2 771.89 μmolTE/100 g，超臨界流體CO2萃取法的Fe3+還原能力最弱，為780.47 μmolTE/100 g。在同一質(zhì)量濃度下(20.0 mg/mL)，直壓冷榨法和超臨界CO2流體萃取法制得的翅果油非極性部分的Fe3+還原能力相近，但直壓冷榨法制得翅果油極性部分的Fe3+還原能力強于超臨界CO2流體萃取法制得翅果油極性部分。而全油部分中，超臨界CO2流體萃取法的Fe3+還原能力遠(yuǎn)高于直壓冷榨法，說明與直壓冷榨法相比，超臨界CO2流體萃取法更有利于提高翅果油中非極性部分的抗氧化能力。

2.2 不同提取工藝制得的翅果油中生物活性成分的比較(見表1)

由表1可見：有機(jī)溶劑提取法的翅果油中VE含量最高，達(dá)到110.73 mg/100 g，超臨界CO2流體萃取法的次之；有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2流體萃取法的翅果油中總甾醇含量顯著高于直壓冷榨法、直壓熱榨法和紅外熱榨法(p<0.05)，直壓熱榨法結(jié)果與Dabrowski等[14]的研究結(jié)論相同。這可能是由于熱榨前處理溫度過高引起翅果油中甾醇發(fā)生降解，對翅果油中總甾醇含量有較大影響[15]。翅果油中甾醇主要有自由態(tài)甾醇以及與脂肪酸、酚酸形成的甾醇酯兩種存在形式。直壓熱榨法和紅外熱榨法翅果油中總甾醇含量顯著高于直壓冷榨法(p<0.05)，這可能是因為直壓熱榨法和紅外熱榨法在前處理時，部分甾醇酯發(fā)生分解，使得甾醇含量增加。不同提取工藝制得的翅果油中角鯊烯含量按由高到低的順序為直壓熱榨法、超臨界CO2流體萃取法、有機(jī)溶劑提取法、紅外熱榨法和直壓冷榨法。在直壓冷榨法、直壓熱榨法和紅外熱榨法中，直壓熱榨法制得的翅果油中的角鯊烯含量顯著高于其他兩種壓榨提取工藝(p<0.05)，說明對翅果油樹種子進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒崽幚?，更有利于翅果油中角鯊烯的提取?/p>

表1 不同提取工藝制得的翅果油中主要生物活性成分含量 mg/100 g

2.3 翅果油中生物活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性

對不同提取工藝制得的翅果油中的微量生物活性成分如角鯊烯、總甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇、β-香樹素、VE總量、α-生育酚(α-TP)、γ-生育酚(γ-TP)、δ-生育酚(δ-TP)、α-生育三烯酚(α-T3)、γ-生育三烯酚(γ-T3)和δ-生育三烯酚(δ-T3)與翅果油的抗氧化能力(DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基清除能力和Fe3+還原能力)進(jìn)行相關(guān)性分析，研究不同提取工藝制得的翅果油中的微量生物活性成分對翅果油抗氧化能力的貢獻(xiàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2可見，不同提取工藝制得的翅果油中各微量生物活性成分與不同抗氧化能力評價指標(biāo)之間的相關(guān)性各有不同。翅果油抗氧化能力與翅果油中甾醇、生育酚、生育三烯酚總量和單體，以及角鯊烯均存在極顯著的正相關(guān)性(p<0.01)。

表2 不同提取工藝制得翅果油微量生物活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

在本試驗中，DPPH自由基清除能力與翅果油中微量生物活性成分含量的相關(guān)系數(shù)為0.811～0.916，可以推測相關(guān)系數(shù)最高的δ-生育酚和γ-生育酚是翅果油中重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。羥基自由基清除能力與翅果油中微量生物活性成分含量的相關(guān)系數(shù)為0.845～0.940，可以推測相關(guān)系數(shù)最高的γ-生育酚可能為翅果油中重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。ABTS自由基清除能力與翅果油中微量活性成分含量的相關(guān)系數(shù)為0.634～0.917，F(xiàn)e3+還原能力與翅果油中微量活性成分含量的相關(guān)系數(shù)為0.554～0.853，可以推測相關(guān)系數(shù)最高的羽扇豆醇是翅果油中重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。因此，推測翅果油中δ-生育酚、γ-生育酚和羽扇豆醇是重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。

3 結(jié) 論

對翅果油抗氧化能力評價的4種方法中：在DPPH自由基清除能力評價中，5種提取工藝制得的翅果油全油及其極性和非極性部分的抗氧化能力各不相同；在羥基自由基清除能力評價中，5種提取工藝制得的翅果油全油及其極性和非極性部分的抗氧化能力相近；在ABTS自由基清除能力評價中，有機(jī)溶劑提取法的翅果油全油及其極性和非極性部分的抗氧化能力最強，超臨界CO2流體萃取法的翅果油全油和極性部分抗氧化能力最弱，直壓熱榨法的非極性部分抗氧化能力最弱；在Fe3+還原能力評價中，有機(jī)溶劑提取法的翅果油全油和非極性部分的抗氧化能力最強，紅外熱榨法的極性部分抗氧化能力最強。有機(jī)溶劑提取法制得的翅果油中VE含量最高，超臨界CO2流體萃取法的次之；有機(jī)溶劑提取法和超臨界CO2流體萃取法的翅果油中總甾醇含量顯著高于直壓冷榨法、直壓熱榨法和紅外熱榨法(p<0.05)；翅果油中角鯊烯含量按照直壓熱榨法、超臨界CO2流體萃取法、有機(jī)溶劑提取法、紅外熱榨法和直壓冷榨法的順序依次降低。相關(guān)性分析表明，翅果油中各生物活性成分含量與4種體外抗氧化活性指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)，γ-生育酚、δ-生育酚和羽扇豆醇是翅果油中重要的抗氧化基礎(chǔ)物質(zhì)。