磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠抑郁和焦慮樣行為*

張俊芳，張忠敏，趙 鑫，劉愛明，郭潔潔，沈璐艷，王欽文，王 闖△

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211;2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

抑郁癥與焦慮癥作為神經(jīng)精神領(lǐng)域兩大心境障礙性疾病，嚴(yán)重威脅著患者的生活及工作。抑郁癥以持續(xù)性心境障礙及興趣降低為主，并伴隨其它心理及軀體癥狀，以其高患病率、復(fù)發(fā)率及自殺率成為神經(jīng)精神科學(xué)界研究的重點。焦慮癥又稱焦慮性神經(jīng)癥，是一種以焦慮情緒為主的神經(jīng)癥，主要表現(xiàn)為發(fā)作性或持續(xù)性的焦慮、緊張、驚恐不安等焦慮情緒，并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張與運動不安等癥狀。大量研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥與焦慮癥具有較高的共患率，彼此“如影隨形”。據(jù)WHO和美國Michigan大學(xué)流行病學(xué)調(diào)查顯示，兩者共患率達(dá) 50%［1］，并且85%的抑郁癥患者伴有焦慮癥狀［2］。因此，尋找兩種疾病的共同藥物作用靶標(biāo)具有重要的研究意義。單胺神經(jīng)系統(tǒng)在人和動物的抑郁癥及焦慮癥發(fā)病中起著重要作用。現(xiàn)存的抗抑郁及抗焦慮藥物能夠迅速改善腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的改變，但是其藥效的發(fā)揮卻延遲到持續(xù)給藥3～8周后。這表明單胺能神經(jīng)系統(tǒng)作為抗抑郁及抗焦慮藥物作用靶標(biāo)有待證實［3］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)與精神疾病具有較強的相關(guān)性。其作為高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量表達(dá)且具有重要調(diào)控作用。GSK3有2種高度同源(84%序列同源)的亞型:GSK3α和GSK3β。情感穩(wěn)定劑鋰鹽對GSK3抑制作用的發(fā)現(xiàn)［4］，使其在情感障礙病理生理機制中的作用受到重視，其中GSK3β的研究較為深入，本文將對GSK3α和GSK3β在抑郁和焦慮樣行為中的調(diào)節(jié)作用及其機制進(jìn)行深入研究。大量研究發(fā)現(xiàn)GSK3α和GSK3β的活性可受磷酸化調(diào)節(jié):絲氨酸殘基Ser21-GSK3α和Ser9-GSK3β被磷酸化后分別介導(dǎo)GSK3α和GSK3β的活性抑制;酪氨酸殘基Tyr279-GSK3α和Tyr216-GSK3β被磷酸化后分別介導(dǎo)GSK3α和GSK3β的活性增強。GSK3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要介導(dǎo)胰島素樣受體、生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB)等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過干擾信號分子的表達(dá)及下游基因表達(dá)、神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)、炎癥及凋亡過程等，最終誘導(dǎo)多種神經(jīng)精神癥狀［5-6］。因此，GSK3有望成為調(diào)控抑郁樣及焦慮樣行為癥狀的有效藥物作用靶標(biāo)。事實上，選擇GSK3作為情緒障礙(mood disorders)治療的藥物作用靶標(biāo)起源于1996年報道發(fā)現(xiàn)鋰可以作為GSK3的抑制劑，通過增強GSK3的抑制性絲氨酸殘基磷酸化直接抑制GSK3和介導(dǎo)蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)信號通路間接抑制GSK3的活性而發(fā)揮作用［7-8］。然而 GSK3 尤其是 Ser21-GSK3α、Ser9-GSK3β、Tyr279-GSK3α 和 Tyr216-GSK3β 在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為中的調(diào)節(jié)作用及機制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，cAMP和cGMP作為第二信使參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑郁癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是催化 cAMP和cGMP水解酶超級家族。PDE目前有11個家族成員(PDE1～11)。其中，PDE4、PDE7和 PDE8為 cAMP特異性的水解酶，PDE5、PDE6和PDE9為cGMP特異性的水解酶，其它PDE則以這2種第二信使為底物，對cAMP和cGMP均可水解［9］。cAMP作為體內(nèi)重要的第二信使，對眾多的細(xì)胞功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺以及谷氨酸的突觸傳遞。因此，通過有效調(diào)節(jié)PDE4水平，從而上調(diào)cAMP，有望在抑郁癥及焦慮癥治療中發(fā)揮重要作用。但是，PDE4具有A、B、C及D四種亞型，且研究發(fā)現(xiàn)PDE4 A、B及D亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有較高表達(dá)，PDE4 C亞型僅在外周系統(tǒng)表達(dá)。因此，闡明何種亞型在情緒障礙中的調(diào)節(jié)作用將為發(fā)現(xiàn)新型抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)提供希望。目前最新研究表明，PDE4D在海馬內(nèi)高度分布且作為cAMP的主要水解亞型有望成為新型抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)。因此，探討慢性應(yīng)激動物模型腦內(nèi)PDE4的表達(dá)，尤其在水解cAMP及抑郁癥、焦慮癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的PDE4D的表達(dá)，值得進(jìn)一步關(guān)注。

咯利普蘭(rolipram)是一種高效的PDE4特異性抑制劑，一直以來作為抑郁癥研究領(lǐng)域的一個重要工具藥被大量研究。盡管rolipram由于致嘔吐等不良反應(yīng)在進(jìn)入臨床試驗后很快退市，但是臨床前研究顯示rolipram等PDE4抑制劑可能是通過cAMP/蛋白激酶(protein pinase A，PKA)/CREB/BDNF信號通路在抗抑郁癥中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用［10］，并且也顯示出良好的抗焦慮樣作用。還有研究顯示BDNF可能通過介導(dǎo)PKB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對GSK3的磷酸化過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此，有理由相信rolipram可能會通過BDNF進(jìn)一步介導(dǎo)GSK3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。但是，rolipram的抗抑郁及抗焦慮作用是否單純通過CREB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用?rolipram能否介導(dǎo)GSK3這個在情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子?CREB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否對GSK3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用?這一系列問題本研究將予以重點闡明。

材料和方法

1 動物

成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(150～180)g(寧波大學(xué)實驗動物中心)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(23±2)℃，濕度保持在(55±15)%，光/暗周期為12 h/12 h(光照時間6:00～18:00)。自由飲食，飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境后開始實驗流程。每天給藥前記錄動物體重，分析實驗周期內(nèi)動物體重變化情況。動物實驗經(jīng)寧波大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，遵照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物操作規(guī)程(NIH Publications No.80～23)進(jìn)行。

2 主要試劑

氯化鋰(LiCl;Sigma-Aldrich)及rolipram(Sigma-Aldrich)分別溶于含有1%DMSO(Sigma-Aldrich)的生理鹽水，置于4℃冰箱中備用。LiCl(100 mg/kg)及 rolipram(1 mg/kg)按照 10 mL·kg-1·d-1每日固定時間腹腔注射給藥，空白對照組與模型組給予等量的空白溶劑。H89(PKA拮抗劑;Sigma-Aldrich)由人工腦脊液配制溶解(6×106μg/L)，每次使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。

3 主要方法

3.1 實驗分組 (1)40只SD大鼠(150～180 g)隨機分為4組:空白對照組、模型組、陽性對照藥LiCl組及rolipram組。所有動物適應(yīng)環(huán)境1周后在不給予任何處理因素前提下第0 d進(jìn)行1次曠場實驗，第1 d開始模型組、LiCl組及rolipram組每日固定時間分別腹腔注射空白溶劑、LiCl(100 mg/kg)及rolipram(1 mg/kg)，1 h后進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激，每天束縛6 h?？瞻讓φ战M不進(jìn)行束縛應(yīng)激，但每天固定時間在同一實驗環(huán)境飼養(yǎng)，并腹腔注射等量空白溶劑。第22 d，4組動物給藥后1 h，進(jìn)行強迫游泳實驗的適應(yīng)訓(xùn)練，每只動物自由游泳15 min。24 h后，即第23 d進(jìn)行檢測，每只動物游泳5 min，并記錄分析每只動物的逃避行為(攀爬、游泳)及不動時間。第24 d進(jìn)行高架十字迷宮測試，以檢測動物的焦慮樣行為。第25 d再次進(jìn)行曠場實驗，以分析應(yīng)激及藥物對動物的影響。此項實驗結(jié)束后，立即處死動物并取雙側(cè)海馬組織，免疫印跡法檢測海馬內(nèi)分子指標(biāo)的變化，流程見圖1A。(2)30只SD大鼠(180～200 g)平均分為6組，雙側(cè)海馬CA1區(qū)手術(shù)埋管并恢復(fù)7 d后進(jìn)行慢性應(yīng)激處理21 d，并在應(yīng)激前微量注射H89，腹腔注射LiCl和rolipram。每次實驗前將H89(6×106μg/L)生理鹽水以1 μL/min的速度緩慢注射至CA1區(qū)，每側(cè)分別注射1 μL，注射完畢后留針5 min以防液體返流。雙側(cè)海馬用于檢測PDE4D、PKA、p-CREB及磷酸化絲氨酸殘基9糖原合成酶激酶3β(p-Ser9-GSK3β)的表達(dá)，流程見圖1B。

Figure 1.Schedules of drug treatments and behavioral tests.A:the first open field test(OFT)was conducted on day 0 before drug treatments and stress.Behavioral tests was carried out on days 22～25(1 h after the injection of drugs or vehicle).B:seven days after the surgery，chronic restraint stress was conducted for 21 d after microinjection of PKA antagonist(H89)and intraperitoneal(ip)injection of lithium chloride(LiCl)and rolipram everyday.FST:forced swimming test;EPM:elevated plus-maze圖1 實驗給藥及行為學(xué)流程

3.2 大鼠海馬CA1區(qū)手術(shù)埋管 將大鼠用水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀。消毒、切開頭部皮膚(以兩眼連線的中點為起點，兩耳后緣連線的中點為終點)，暴露手術(shù)視野，用棉簽蘸少許50%H2O2涂于顱骨表面使前囟清晰暴露，以前囟為坐標(biāo)原點，后退3.5 mm，旁開2.5 mm處鉆孔，為左右兩側(cè)海馬的進(jìn)入點。以軟腦膜為起始點將定做好的定位管進(jìn)針3.0 mm，進(jìn)入海馬CA1區(qū)，用牙科牙托粉固定，并使動物術(shù)后恢復(fù)1周時間。

3.3 慢性束縛應(yīng)激(chronic restrain stress) 由透明鋼化玻璃統(tǒng)一制作的長度22 cm、直徑8 cm的束縛器，前端有通氣孔用于動物呼吸外界空氣，尾端為設(shè)計一可關(guān)閉的圓形門。動物面朝頂端被輕柔放置入束縛器后迅速關(guān)閉尾端的門，并開始計時。每天同一時間進(jìn)行束縛應(yīng)激，每次每只動物進(jìn)行6 h。

3.4 曠場實驗(open field test) 曠場實驗是以實驗動物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間等，評價實驗動物在陌生環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。實驗裝置由曠場反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)兩部分組成。大鼠曠場反應(yīng)箱高30～40 cm，底邊長100 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個4 cm×4 cm小方格，正上方2 m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內(nèi)部。曠場光照為全人工照明，可人為設(shè)定“白天”和“黑夜”，白天由兩側(cè)墻壁的4只節(jié)能燈發(fā)出約200 Lux照度來模擬，夜晚由一側(cè)墻壁的紅外光源提供照明。實驗人員和計算機等設(shè)備位于另一房間以減小對動物的干擾，實驗室背景噪音控制在65 dB以下。將動物放入箱內(nèi)底面中心，同時進(jìn)行攝像和計時，觀察時間設(shè)定為5 min。每只動物檢測后清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次動物余留的信息(如動物的大/小便、氣味)影響下次測試結(jié)果。根據(jù)計算機軟件記錄并分析動物肢體越過的格子數(shù)即水平得分(crossing)、后肢站立次數(shù)即垂直得分(rearing)和修飾次數(shù)(grooming)。

3.5 強迫游泳實驗(forced swimming test) 該實驗方法是一種行為絕望實驗法，其基本原理是將大鼠放進(jìn)一個有限的空間(直徑20 cm，水面高度30 cm，高度50 cm的圓筒狀塑膠玻璃器皿內(nèi))使之游泳，開始時拼命游泳力圖逃脫，很快就變成漂浮不動狀態(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身體不至于沉下去，實際是動物放棄逃脫的希望，屬于行為絕望，反映了動物的抑郁樣行為。實驗包括訓(xùn)練階段及測試階段:第22 d各組動物依次游泳15 min，以適用環(huán)境;第23 d進(jìn)行測試，每只動物游泳5 min，并記錄動物在5 min內(nèi)的攀爬時間(climbing)、游泳時間(swimming time)及不動時間(immobility)。攀爬行為定義為:動物在游泳過程中前肢順著器皿方向主動向上運動;游泳時間定義為:動物在器皿內(nèi)主動地游泳運動的時間;不動時間定義為:動物在器皿內(nèi)不表現(xiàn)任何逃避行為的時間。整個實驗中，水溫保持在(23±2)℃。每只動物實驗后更換器皿內(nèi)的水以保持水的清潔，消除動物糞便及氣味的干擾。

3.6 高架十字迷宮實驗(elevated plus-maze) 高架十字迷宮是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)。實驗儀器由黑色塑膠玻璃做成，包括開臂區(qū)(長50 cm，寬10 cm)，閉臂(長50 cm，寬10 cm，高20 cm)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)，相同類型的臂通過中央?yún)^(qū)相對連接。整個儀器置于距離地面50 cm的位置。每只動物實驗時面對閉臂置于中央?yún)^(qū)位置，并使動物自由探索5 min，記錄:(1)進(jìn)入開臂及閉臂的次數(shù);(2)在開臂及閉臂內(nèi)的停留時間(動物的四肢全部進(jìn)入一個臂內(nèi)方可認(rèn)為有效)。每只動物實驗結(jié)束后采用10%乙醇進(jìn)行清洗實驗儀器以消除動物氣味的干擾。

（1）土地及植被破壞面積估計。工程建設(shè)過程中，地面設(shè)施的興建、開挖、填筑等都不同程度、不同形式地擾動了原地貌形態(tài)，損壞了地表土體結(jié)構(gòu)和地面林草植被。根據(jù)對主體工程報告的分析及現(xiàn)場勘察，工程建設(shè)占壓土地、擾動原地表面積共37.06hm2。

3.7 免疫印跡實驗 100 mg腦組織加入含有蛋白酶抑制劑的1 mL裂解液中，盡量保持低溫并快速勻漿(13000 r/min，4℃)，離心30 min，取少量上清進(jìn)行蛋白濃度定量;將所有組織蛋白濃度定量至4×106μg/L，并與2倍的上樣緩沖液1∶1混合后100℃沸水浴5 min，將所有樣本冷卻后保存至-20℃冰箱中備用。每組上樣50 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V穩(wěn)定電壓轉(zhuǎn)膜3 h至PVDF膜，并用封閉液封閉2 h，TBST清洗5 min后分別加入Ⅰ抗［家兔來源抗 PDE4D(1∶800)、PKA(1∶1000)、p-CREB(1∶1500)、BDNF(1 ∶500)、p-Ser21-GSK3α(1∶1000)、p-Ser9-GSK3β(1∶1000)、p-Tyr279-GSK3α(1∶1000)、p-Tyr216-GSK3β(1∶1000)、total GSK3α(1∶2000)、total GSK3β (1∶2000)和小鼠來源抗GAPDH(1∶5000);Millopore］后置于4℃冷庫振蕩過夜。TBST清洗I抗后常溫孵育II抗［山羊抗兔IgG(1∶10000)及山羊抗小鼠 IgG(1∶10000);Cell Signal］1 h，TBST清洗后曝光照相。并采用軟件BandScan分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 Rolipram對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的體重丟失的影響

各組動物在第0 d體重(即初始體重)無顯著差異。重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析顯示時間效應(yīng)(day)［F(3，108)=900.500，P ＜0.01］，處理效應(yīng)(treatment)［F(3，108)=6.685，P ＜0.01］以及時間效應(yīng)與處理效應(yīng)的交互作用(day×treatment)［F(9，108)=10.750，P＜0.01］均有顯著差異。隨著慢性應(yīng)激的持續(xù)進(jìn)行，應(yīng)激組動物與空白對照組相比體重逐漸丟失，比較顯示第14 d(P＜0.01)及21 d(P＜0.01)體重下降顯著，而LiCl及rolipram與應(yīng)激組相比在第14 h(LiCl，P＜0.05;rolipram，P＜0.01)及21 h(LiCl，P＜0.01;rolipram，P＜0.01)均顯示出明顯逆轉(zhuǎn)了體重下降效應(yīng)，見圖2。

Figure 2.Effects of chronic restraint stress and rolipram administration on body weight in 21 days.Data were analyzed using repeated measures ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖2 慢性束縛應(yīng)激及rolipram對21 d內(nèi)動物體重的影響

2 Rolipram對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響

接受23 d慢性束縛應(yīng)激的應(yīng)激組大鼠與空白對照組相比，在強迫游泳實驗中表現(xiàn)出不動時間顯著延長，表現(xiàn)出抑郁樣行為特征。各組不動時間的總體比較差異顯著［F(3，36)=18.100，P ＜0.01］，兩兩比較顯示應(yīng)激組動物與空白對照組相比不動時間顯著延長(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.01)與rolipram(P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)，見圖3A。進(jìn)一步分析動物的攀爬次數(shù)表明，應(yīng)激組與空白對照組相比顯著降低了動物的攀爬次數(shù)(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.05)與rolipram(P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)，表明rolipram顯著逆轉(zhuǎn)了抑郁樣行為效應(yīng)，見圖3B。然而，各組動物游泳時間的比較均未見顯著差異［F(3，36)=0.447，P ＞ 0.05］，表明各組動物運動行為能力無顯著差異，見圖3C。

Figure 3.Effect of rolipram on depression-like behavior induced by chronic restraint stress，including immobility time(A)，climbing behavior(B)，and swimming behavior(C)in forced swimming test.Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖3 Rolipram對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響

3 Rolipram對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為的影響

高架十字迷宮實驗顯示，各組動物在開臂內(nèi)時間比［F(3，36)=11.450，P ＜0.01］(圖4A)及穿越開臂次數(shù)［F(3，36)=5.101，P ＜0.01］(圖4B)的總體比較差異顯著，兩兩比較顯示應(yīng)激組動物與空白對照組相比在開臂內(nèi)時間比(P＜0.01)及穿越開臂次數(shù)均顯著降低(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.01;P＜0.01)與rolipram(P＜0.01;P＜0.01)組均顯著逆轉(zhuǎn)了這兩項指標(biāo)，表現(xiàn)出顯著抗焦慮作用。然而，各組穿越閉臂次數(shù)未見顯著差異［F(3，36)=0.317，P＞0.05］，表明各組動物的自主活動能力無顯著差異，見圖4B。在高架十字迷宮中慢性束縛應(yīng)激在誘導(dǎo)動物焦慮樣行為的同時，未見其對動物自主行為能力產(chǎn)生顯著影響，見圖4。

Figure 4.Effect of rolipram on anxiety-like behavior induced by chronic restraint stress，including percentage of time spent in openarm exploration(A)and the numbers of entries into open or closed arm(B)in elevated plus-maze.Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖4 Rolipram對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為的影響

4 應(yīng)激前及應(yīng)激25 d后各組動物在曠場實驗中行為學(xué)比較

應(yīng)激前(即第0 d)進(jìn)行的曠場實驗表明，各組動物水平穿格次數(shù)(P＞0.05)、直立次數(shù)(P＞0.05)及修飾次數(shù)(P＞0.05)均未見顯著差異，見圖5A;經(jīng)過25 d的慢性束縛應(yīng)激后再次進(jìn)行曠場實驗表明，慢性應(yīng)激組動物與空白對照組相比水平穿格次數(shù)(P＜0.01)、直立次數(shù)(P＜0.05)及修飾次數(shù)(P＜0.01)均顯著降低，而 LiCl(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01)與rolipram(P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)，提示rolipram具有逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為效應(yīng)，見圖5B。另外，這一實驗也表明慢性束縛應(yīng)激建立的大鼠抑郁模型是可靠的。

Figure 5.The open field locomotor activities before(A)or after(B)chronic restraint stress，including crossing，rearing and grooming.Data were analyzed using oneway ANOVA following by Bonferroni post test.E.n=10.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖5 應(yīng)激前及應(yīng)激25 d后各組動物在曠場實驗中行為學(xué)比較

5 Rolipram對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的p－CREB、BDNF和PKA表達(dá)下調(diào)的影響及PKA抑制劑H89的阻斷作用

大量研究表明cAMP-CREB-BDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激25 d后應(yīng)激組與空白組相比，海馬內(nèi)p-CREB(圖6B)及BDNF(圖6C)表達(dá)顯著下調(diào)［p-CREB，F(xiàn)(3，12)=8.471，P ＜0.01;BDNF，F(xiàn)(3，12)=4.439，P ＜0.05］，rolipram顯著逆轉(zhuǎn)了p-CREB及BDNF表達(dá)的下調(diào)(p-CREB，P＜0.01;BDNF，P ＜0.05)，而LiCl未見對p-CREB及BDNF表達(dá)的顯著增高，僅僅表現(xiàn)出輕微上調(diào)作用。進(jìn)一步設(shè)計實驗研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激21 d后應(yīng)激組與空白組相比，海馬內(nèi)p-CREB表達(dá)顯著下調(diào)［F(5，24)=43.260，P ＜ 0.01］，見圖 6F，海馬內(nèi)PKA的表達(dá)也顯著下調(diào)［F(5，24)=51.090，P＜0.01］，見圖6E，并且PKA抑制劑H89顯著阻斷了rolipram對p-CREB(P＜0.01)及PKA(P＜0.01)的上調(diào)作用，見圖6E-F。

6 Rolipram對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下GSK3及其不同磷酸化狀態(tài)表達(dá)的影響和PKA抑制劑H89的阻斷作用

Figure 6.Effects of rolipram and H89 on down-regulation of p-CREB(B and F)，BDNF(C)and PKA(E)expression induced by chronic restraint stress in the hippocampus of rats.Data were analyzed using one-way ANOVA following by Bonferroni post test.E.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group;▲▲P＜0.01 vs LiCl+stress group;△△P＜0.01 vs rolipram+stress group.圖6 Rolipram及PKA抑制劑H89對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的p－CREB、BDNF和PKA表達(dá)下調(diào)的影響

7 Rolipram對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下PDE4D表達(dá)的影響

慢性束縛應(yīng)激21 d，動物海馬內(nèi)PDE4D的表達(dá)顯著提高［F(5，24)=13.840，P ＜0.01］，rolipram 顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(P＜0.01)，提示rolipram可能主要通過抑制PDE4D的活性發(fā)揮上調(diào)PKA/CREB信號通路;而LiCl并未能顯著下調(diào)PDE4D的表達(dá)［F(5，24)=13.840，P ＞ 0.05］，提示 LiCl對 GSK3 介導(dǎo)的信號通路的影響可能并不通過PKA/CREB信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，見圖8。

討 論

為了研究藥物對動物抑郁和焦慮樣行為的影響，我們選擇了大鼠慢性束縛應(yīng)激模型，這是基于大量研究表明慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)了哺乳動物的抑郁和焦慮樣行為［11-12］。我們將大鼠慢性束縛應(yīng)激時間每日由4 h增加到6 h，持續(xù)進(jìn)行3周以上，發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激顯著增強了動物在強迫游泳中的不動時間并顯著降低了高架十字迷宮中動物的開臂探索行為，表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁和焦慮樣行為。故本實驗證明慢性束縛應(yīng)激與慢性不可預(yù)見性應(yīng)激相比雖然應(yīng)激方式單調(diào)，但應(yīng)激時間較久、刺激性較強，可以成為一種較好的獲得抑郁癥及焦慮癥動物模型的方法。因此，本實驗在眾多誘導(dǎo)手段中［13］選擇此方法作為誘導(dǎo)模型，具有穩(wěn)定、易操作、干擾因素少等特點，為研究抑郁與焦慮共患病提供了良好的動物模型。

Figure 7.Effects of rolipram and H89 on expression of total GSK3α (F)，total GSK3β (G)，p-Ser21-GSK3α (B)，p-Ser9-GSK3β(C and I)，p-Tyr279-GSK3α(D)，p-Tyr216-GSK3β(E).E.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle trol group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group;△△P＜0.01 vs rolipram+stress group.圖7 Rolipram及H89對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下total GSK3α、total GSK3β及其不同磷酸化狀態(tài)(p－Ser21－GSK3α、p－Ser9－GSK3β、p－Tyr279－GSK3α和 p－Tyr216－GSK3β)表達(dá)的影響

Figure 8.Effects of rolipram and H89 on down-regulation of PDE4D induced by chronic restraint stress.E.n=5.＊＊P ＜0.01 vs vehicle group;##P ＜0.01 vs vehicle+stress group.圖8 Rolipram及H89對慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的PDE4D上調(diào)作用的影響

慢性束縛應(yīng)激模型穩(wěn)定地誘導(dǎo)出抑郁和焦慮樣行為，再次證明了:(1)抑郁癥與焦慮癥共患率高的特點;(2)慢性應(yīng)激因素是抑郁癥與焦慮癥患病的共同發(fā)病因素;(3)該動物模型腦內(nèi)信號變化為尋求抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)提供了研究思路。大量研究已表明，cAMP/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在認(rèn)知功能、而且在抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［14-15］。cAMP特異性水解酶抑制劑——rolipram 因具有顯著的致嘔吐作用而未能進(jìn)入臨床，但其作為PDE4抑制劑工具藥通過上調(diào)cAMP/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善認(rèn)知功能［16］、抗抑郁［17］及抗焦慮［15］的作用已被廣泛研究。然而也有研究發(fā)現(xiàn)rolipram不僅無抗焦慮作用，反而可以誘導(dǎo)焦慮樣行為［18］，這提示rolipram對情緒穩(wěn)定的作用及機制還有待進(jìn)一步明確。神經(jīng)營養(yǎng)學(xué)說研究表明BDNF作為一個重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子在cAMP/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能執(zhí)行(認(rèn)知增強、抗抑郁及抗焦慮)中發(fā)揮重要作用。其主要通過結(jié)合其受體酪氨酸受體激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)進(jìn)而激活 PI3K/Akt(PKB)等信號通路來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。BDNF作為cAMP/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游CRE的表達(dá)產(chǎn)物之一，通過結(jié)合受體TrkB進(jìn)而激活PI3K/Akt(PKB)等信號通路也可在認(rèn)知增強、抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。大量研究顯示GSK3作為BDNF下游調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，受 PKB及蛋白激酶C的調(diào)控［19］。因此，cAMP/CREB/BDNF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能對GSK3這一情緒調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子在抑郁癥及焦慮癥中發(fā)揮調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁和焦慮樣行為的出現(xiàn)，動物海馬內(nèi)p-CREB/BDNF及具有抑制性活性的絲氨酸殘基磷酸化GSK3(p-Ser21-GSK3α和p-Ser9-GSK3β)的表達(dá)均顯著下調(diào)，而具有增強GSK3活性的酪氨酸殘基磷酸化GSK3(p-Tyr279-GSK3α和p-Tyr216-GSK3β)、total GSK3α 和 total GSK3β 表達(dá)均未見顯著變化;進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)LiCl作為GSK3抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁和焦慮樣行為，增強了 p-Ser21-GSK3α和 p-Ser9-GSK3β的表達(dá)，而未見對 p-Tyr279-GSK3α、p-Tyr216-GSK3β、total GSK3α 和 total GSK3β 表達(dá)的影響，這提示LiCl作為GSK3抑制劑可能通過增強具有抑制GSK3活性的p-Ser21-GSK3α和p-Ser9-GSK3β的表達(dá)而對GSK3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制作用，這與Eom等［20］2009年的研究結(jié)果一致，且本研究未見LiCl對p-CREB及BDNF表達(dá)的增強作用。但是LiCl的作用僅僅通過上調(diào)具有抑制性的絲氨酸殘基磷酸化GSK3卻能顯著逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的行為學(xué)障礙，也證明了GSK3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑郁及焦慮癥發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。進(jìn)一步分析PDE4抑制劑rolipram的作用發(fā)現(xiàn)，其不僅具有同LiCl相似的對GSK3信號通路的作用，而且顯著增強了p-CREB/BDNF的表達(dá)，并有顯著的抗抑郁及抗焦慮作用。這些實驗數(shù)據(jù)說明了一直被廣泛研究的rolipram抗抑郁及抗焦慮的作用可能不僅局限于通過p-CREB/BDNF信號通路，還可能通過下調(diào)GSK3介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮作用。因此，有必要通過過度激活GSK3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否顯著削弱rolipram的作用來進(jìn)一步深入研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)LiCl聯(lián)合rolipram用藥與單獨給予LiCl相比對p-Ser9-GSK3β的上調(diào)作用提高將近1倍，進(jìn)一步提示rolipram對p-Ser9-GSK3β的調(diào)節(jié)能力與GSK3抑制劑相似。

但是，PDE4抑制劑誘導(dǎo)的GSK3信號分子的改變與其介導(dǎo)的cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系如何，是否具有特異性的上下游關(guān)系值得關(guān)注。我們進(jìn)一步研究表明PKA阻斷劑H89顯著阻斷了rolipram對PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上調(diào)作用，并且有效阻斷了rolipram對p-Ser9-GSK3β的上調(diào)作用，提示PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對p-Ser9-GSK3β發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。另外，既然我們選擇PDE4抑制劑作為抗抑郁及抗焦慮癥的藥物作用靶標(biāo)，本實驗?zāi)Ｐ椭蠵DE4本身的活性是否發(fā)生變化決定了該藥物作用靶標(biāo)的特異性及有效性。我們的研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激顯著提高了海馬內(nèi)PDE4D的表達(dá)，這可能是慢性應(yīng)激顯著下調(diào)pCREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要原因之一。本研究中我們之所以選擇PDE4D進(jìn)行檢測，是因為PDE4D在大腦皮層和海馬都有很高的分布［21］。與此相一致的是，PDE4D基因敲除小鼠皮層和海馬的PDE4活性降低達(dá)60%［22］，提示PDE4D有望成為抗抑郁及抗焦慮作用的有效藥物靶標(biāo)。

本研究中我們一直擔(dān)心，rolipram的致嘔吐作用是否會對行為學(xué)及動物的精神狀態(tài)產(chǎn)生影響?我們的研究結(jié)果表明，隨著慢性應(yīng)激時間的延長，應(yīng)激組動物體重顯著丟失，而LiCl與rolipram均逆轉(zhuǎn)了動物體重的丟失。這一結(jié)果證實了rolipram的給藥并未因嘔吐反應(yīng)而影響動物的攝食行為而影響動物的體重。這一點得益于我們前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠給予rolipram(1 mg/kg)后1 h其嘔吐反應(yīng)基本消失，且我們的行為學(xué)也選擇在給藥后1 h進(jìn)行，在一定程度上也減少了嘔吐反應(yīng)對行為學(xué)的影響，這一發(fā)現(xiàn)也得到其他學(xué)者研究結(jié)果的支持［9］。

我們的研究在應(yīng)激前與慢性應(yīng)激后均進(jìn)行了曠場實驗以比較動物的自主活動能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激前各組動物的自主活動能力無顯著差異，但經(jīng)過25 d的慢性應(yīng)激后應(yīng)激組動物自主活動能力顯著減少，而LiCl及rolipram均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)。自主活動能力的減少是長期慢性應(yīng)激的結(jié)果，恰恰證明了慢性束縛應(yīng)激穩(wěn)定誘導(dǎo)了動物的情緒障礙。但是，還需考慮自主活動能力是否會影響對動物強迫游泳及高架十字迷宮的行為測試。事實上，我們強迫游泳中對動物游泳時間的比較以及高架十字迷宮中對動物穿越閉臂次數(shù)的比較均未見顯著差異，表明動物在2個行為學(xué)測試中的自主活動能力未受影響。這與曠場實驗中應(yīng)激誘導(dǎo)了動物的自主活動能力降低并不矛盾，可能因為強迫游泳與高架十字迷宮實驗均是在一種較為危險的環(huán)境下進(jìn)行的，而曠場實驗連續(xù)進(jìn)行2次，且環(huán)境較為溫和。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了PDE4抑制劑的抗抑郁及抗焦慮作用可能通過上調(diào)CREB/BDNF及下調(diào)GSK3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮作用，為探索新型抗抑郁及焦慮共患病藥物新靶標(biāo)提供了思路。

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