黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病KKAy小鼠腎臟TGF－β1和BMP－7 表達的影響*

李姝玉， 柴新樓， 吳 瑩， 賈德賢， 郝 鈺， 蘇瑋蓮， 王 謙△

(1北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京100029;2天津醫(yī)科大學，天津300070)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見而難治的微血管并發(fā)癥，是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。在DN 發(fā)病過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)起著關(guān)鍵的作用，可以促進糖尿病腎小球纖維化和間質(zhì)纖維化過程的發(fā)生、發(fā)展。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性腎臟保護因子，具有抗纖維化的作用，能夠拮抗TGF－β1的作用。黃芪和葛根是治療DN 的常用中藥，能有效改善腎臟功能，然而，其作用機制尚缺乏充分了解。因此，本研究觀察黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病腎病模型KKAy小鼠腎臟TGF－β1和BMP－7 表達的影響，探討黃芪注射液和葛根素注射液治療DN 的有關(guān)作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級KKAy小鼠40 只，雄性，9 ～11 周齡，25 ～28 g，購自中國醫(yī)學科學院動物中心，許可證號為SCXK(京)2005－0013，隨機血糖≥13.9mol/L，確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J 小鼠18 只，雄性，9 ～11周齡，23 ～25 g，許可證號為SCXK(京)2003－0003，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗期間，動物自由飲水，KKAy小鼠給予高脂飼料(中國醫(yī)學科學院動物中心提供)，C57BL/6J 小鼠給予生長維持顆粒飼料(購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，以上動物均飼養(yǎng)在中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)。

2 藥物與試劑

黃芪注射液購自成都地奧九泓制藥廠，規(guī)格為每毫升含生藥2 g，產(chǎn)品批號為0608056。葛根素注射液購自浙江康恩貝制藥股份有限公司，規(guī)格為每毫升含葛根素50 mg，產(chǎn)品批號為0601013。TGF－β1兔抗多克隆抗體和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及高敏過氧化物復合酶購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol 購自Invitrogen，RT－PCR有關(guān)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，TGF－β1上游引物序列5'－TCCCTCAACCTCAAATTATTCA－3'，下游引物序列5'－GCGGTCCACCATTAGCAC－3'，擴增后片段長度為493 bp;BMP－7 上游引物序列5'－GACGCCAAAGAACCACAAGAG－3'，下游引物序列5'－TCACAGTAGTAGGCAGCATAGC－3'，擴增后片段長度為165 bp;β－actin 上游引物序列5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAGG－3'，下游引物序列5'－CACGTCACACTTCATGATGGAG－3'，擴增后片段長度為243 bp。

3 主要儀器

Freestyle 利舒坦血糖儀，日立7600P 全自動生化分析儀，Eppendorf RT－PCR 儀，紫外分光光度計，凝膠成像儀。

4 方法

4.1 動物分組及給藥方法 KKAy小鼠飼養(yǎng)至14周齡時，將其按照隨機血糖分組:模型組(model group，MG)20 只;治療組(treatment group，TRG)20只，每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL·kg－1·d－1)和葛根素注射液(1.3 mL·kg－1·d－1)，2 種藥物先后給藥。18 只C57BL/6J 小鼠作為正常組(normal group，NG)。實驗期間，各組動物自由飲食、飲水。分別于20 周齡、24 周齡和28 周齡處死動物。

4.2 小鼠一般狀態(tài)及體重變化 每天觀察小鼠一般狀態(tài)，隔周稱量各組小鼠體重。

4.3 血清生化指標檢測 剪尾檢測20 周齡、24 周齡和28 周齡各組小鼠空腹血糖(blood glucose，BG)。20 周齡小鼠禁食12 ～14 h 后，處死動物，眼球取血，分離血清，日本日立7600P 全自動生化分析儀測定血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)及血肌酐(serum creatinine，SCr)。24 周齡和28 周齡小鼠指標檢測方法同上。

4.4 免疫組織化學染色 將石蠟包埋的腎組織制成4 μm 厚的切片，用SABC 法檢測腎組織TGF－β1的蛋白表達情況。以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。每張切片隨機選取6 個高倍視野，每組選取6 張切片，Olympus 公司圖像采集系統(tǒng)采集圖像，Image－Pro Plus 5.1 圖像分析軟件進行半定量分析。

4.5 RT－PCR 檢測腎組織TGF－β1和BMP－7 mRNA 表達 按照Trizol 說明書提取腎組織總RNA，紫外分光光度計測定總RNA 質(zhì)量與濃度。每組分別取5 μg 先進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應結(jié)束后分別取4 μL 反應產(chǎn)物，進行多聚酶鏈(PCR)反應，TGFβ1、BMP－7 和β－actin 的退火溫度均為50 ℃，95℃5 min，95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃40 s，擴增36輪。PCR 產(chǎn)物的電泳分析:取10 μL 產(chǎn)物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外燈下根據(jù)PCR marker 位置判斷目標產(chǎn)物，拍照后進行灰度掃描，分別計算TGF－β1和BMP－7 擴增產(chǎn)物的吸光度值與β－actin 擴增產(chǎn)物的吸光度值的比值作為表達水平參數(shù)，進行半定量分析。

5 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)及體重變化情況

模型組小鼠有精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。模型組28 周齡小鼠有1 只死亡。模型組小鼠各時點體重均比正常組增長明顯，差異顯著(P ＜0.01)。治療組小鼠20、24 周齡體重均比正常組增長明顯，差異顯著(P＜0.01);與模型組相比，治療組20 ～28 周小鼠體重增長減緩，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表1。

表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG. NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 25.68 ±4.49(n=6) 30.17 ±1.94(n=6) 32.83 ±3.66 (n=6)MG 41.42 ±2.53＊＊(n=6) 45.13 ±2.09＊＊(n=6) 43.28 ±3.65＊＊(n=7)TRG 36.47 ±3.23＊＊▲(n=6) 39.93 ±3.31＊＊▲▲(n=6) 35.87 ±4.91▲▲(n=8)

2 血清生化指標檢測結(jié)果

從20 周齡開始，模型組及治療組小鼠血糖比正常組高，差異顯著(P ＜0.01)，治療組小鼠空腹血糖較模型組降低，差異顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表2。模型組SCr 自24 周齡開始明顯升高，與正常組相比差異顯著(P ＜0.01);治療組小鼠24 及28 周齡時SCr 水平較模型組明顯降低(P ＜0.01)，并且28 周齡時高于正常組(P ＜0.05)，見表2。模型組自20 周齡開始，TG 和TC 明顯升高，與正常組小鼠相比差異顯著(P ＜0.01);20 和28 周齡時治療組小鼠TG 較模型組有所降低，24 周齡時，治療組小鼠TC 較模型組明顯降低(P ＜0.01)，見表3。

表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group BG(mmol/L)SCr(μmol/L)20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 5.21±0.95 (n=6) 4.25±1.28(n=6) 3.54±1.06(n=6) 10.05±1.13(n=6) 6.21±2.00(n=6) 9.42±2.60(n=6)MG 22.50±2.69＊＊(n=6) 20.85±5.86＊＊(n= 6) 12.54±2.36＊＊(n=7) 9.45±1.41(n=6) 12.08±1.14＊＊(n=6) 19.17±3.38＊＊(n=7)TRG 13.68±3.15＊＊▲▲(n= 6)14.83±3.21＊＊▲(n=6) 7.00±1.51＊＊▲▲(n=8) 10.10±1.12(n=6) 7.70±0.90▲▲(n=6) 13.36±3.07＊▲▲(n=8)

表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group TG TC 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 0.15±0.03(n=6) 0.64±0.06(n=6) 0.65±0.24 (n=6) 2.53±0.23(n=6) 2.04±0.24(n=6) 2.10±0.34(n=6)MG 0.25±0.02＊＊(n=6) 2.20±0.44＊＊(n=6) 1.68±0.60＊＊(n=7) 5.21±1.17＊＊(n=6) 6.48±0.50＊＊(n=6) 6.18±1.73＊＊(n=7)TRG 0.19±0.05▲▲(n=6) 1.79±0.48＊＊(n=6) 1.13±0.48▲(n=8) 5.13±0.85(n=6) 3.86±1.00＊＊▲▲(n=6) 5.43±0.90＊＊(n=8)

3 免疫組化染色結(jié)果

正常組腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞胞漿中均有較弱的TGF－β1表達，見圖1A;模型組與正常組比較，腎小管上皮細胞胞漿中TGF－β1強陽性表達，腎小球內(nèi)也可見表達，但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯，且其表達隨周齡增長而增多，見圖1B。治療組小鼠TGF－β1在腎小球和腎小管的表達均較模型組明顯降低，差異顯著(P ＜0.01)，見圖1C、表4。

4 RT－PCR 檢測TGF－β1和BMP－7 mRNA 的表達

各周齡模型組小鼠腎臟TGF－β1mRNA 表達均比正常組小鼠高，治療組小鼠TGF－β1mRNA 表達比模型組低，差異顯著(P ＜0.05);各周齡模型組小鼠腎臟BMP－7 mRNA 表達均比正常組小鼠低，20和24 周齡治療組小鼠BMP－7 mRNA 表達比模型組高，差異顯著(P ＜0.05)，28 周齡治療組與模型組無顯著差異，見圖2、表5。

Figure 1. Expression of TGF－β1 in renal tissues from each group at the end of 24 weeks (immunohistochemical staining， × 400). A:normal group;B:model group;C:treatment group.圖1 24 周齡各組小鼠腎組織TGF－β1 免疫組化染色

表4 各組小鼠腎臟TGF－β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

表4 各組小鼠腎臟TGF－β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 20 475.72 ±5 204.95 21 363.45 ±5 111.88 22 598.90 ±5 381.02 MG 94 385.10 ±16 695.46＊＊ 142 483.97 ±7 149.30＊＊ 192 384.28 ±6 480.86＊＊TRG 28 405.74 ±11 981.22▲▲ 70 242.29 ±7 839.27＊＊▲▲ 63 171.88 ±5 075.73＊＊▲▲

Figure 2. TGF－β1 and BMP－7 mRNA expression in renal tissues from each group at the end of 24 weeks. M:marker;NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.圖2 24 周齡各組小鼠腎組織TGF－β1 和BMP－7 mRNA 表達情況

表5 各組小鼠腎臟BMP－7 和TGF－β1 的RT－PCR 圖像分析結(jié)果Table 5. Image analysis results examined by RT－PCR of BMP－7 and TGF－β1 in the kidney of mice in various group (±s.n=5)

* P ＜0.05 vs NG;▲P ＜0.05 vs MG.

Group BMP－7 TGF－β 1 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 1.57 ±0.09 1.55 ±0.27 1.65 ±0.61 0.33 ±0.05 0.34 ±0.02 0.35 ±0.01 MG 0.84 ±0.26* 0.86 ±0.33* 0.87 ±0.37* 0.53 ±0.05* 0.59 ±0.06* 0.53 ±0.07*TRG 1.11 ±0.47＊▲ 1.23 ±0.20▲ 0.97 ±0.35* 0.37 ±0.03▲ 0.39 ±0.05▲ 0.37 ±0.02▲

討 論

黃芪注射液為傳統(tǒng)中藥黃芪提取物的滅菌水溶液(10 mL 相當于生藥材20 g)，主要成分為黃芪多糖、黃酮、黃芪皂苷等，具有益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，養(yǎng)心通脈的功效。臨床研究證實黃芪注射液能降糖調(diào)脂，改善糖尿病腎病患者的腎功能［1］。葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根提取物的滅菌水溶液，主要成分為葛根素，為由豆科植物野葛干燥根中提出的一種黃酮苷，其亦為臨床證明有效的單味中藥提取物，實驗研究有明顯的降血糖作用［2］。我們的實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤等癥狀，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組小鼠以上情況得到不同程度的改善。模型組和治療組各時點體重均比正常組增長明顯，但是與模型組相比，治療組20 ～28 周小鼠體重增長減緩。糖尿病模型組小鼠血糖、TG、TC 和SCr 較正常組升高，治療組上述指標仍高于正常組，但較模型組明顯下降，尤其是在治療早期，下降更為明顯，提示黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液有降血糖、降血脂、保護腎功能的作用。

DN 是糖尿病慢性并發(fā)癥，在糖尿病早期尚無腎功損害時，腎臟內(nèi)環(huán)境及超微結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)改變。DN 早期病理改變?yōu)槟I小球體積擴大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生，晚期為腎小球和腎間質(zhì)纖維化，病變本質(zhì)是細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡，ECM 過度積聚和沉積。其中由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)而來的肌成纖維細胞(MFB)能合成大量ECM。很多因素參與促進ECM 的沉積，TGF－β1的作用受到廣泛關(guān)注［3］。TGF－β1在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，包括:促進ECM 成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的合成;抑制ECM 的降解;促進整合素的表達而增強細胞與基質(zhì)的作用;促進腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化等［4－5］。

機體內(nèi)還存在一種天然拮抗TGF－β1的因子，即BMP－7。它可促進胚胎期腎臟發(fā)育過程中間充質(zhì)細胞向上皮細胞的分化，是胚胎腎臟發(fā)育分化及生長不可缺少的重要因子，在成年哺乳動物腎臟中會持續(xù)高度表達。Gould 等［6］證實在腎臟損傷修復的過程中，BMP－7 高表達，根據(jù)其及其受體在腎臟獨特的表達及分布方式推測，它可能具有保護腎臟、防御損傷的作用?，F(xiàn)已證實:BMP－7 可以通過影響TGF－β1/Smad 信號通路阻斷腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化進程，發(fā)揮抗纖維化作用［7］。DN 動物模型中，腎臟BMP－7 及其受體的表達明顯下降，下降幅度與腎纖維化的程度平行［8］，給予外源性BMP－7 治療能明顯延緩DN 的進程，部分逆轉(zhuǎn)腎小球肥大，改善腎功能［9］。

我們的免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠與正常組比較，腎小管上皮細胞胞漿中TGF－β1強陽性表達，腎小球內(nèi)也可見表達，但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯，且其表達隨周齡增長而增多。治療組小鼠腎組織TGF－β1蛋白表達均較模型組明顯降低，差異顯著。RT－PCR 結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟TGF－β1mRNA 表達比正常組小鼠高，治療組小鼠TGF－β1mRNA 表達比模型組表達降低;模型組小鼠腎臟BMP－7 mRNA 表達比正常組小鼠低，20周齡和24 周齡治療組小鼠BMP－7 mRNA 表達比模型組高。這表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2型糖尿病腎病模型KKAy小鼠的腎臟保護作用可能是部分通過抑制DN 腎臟中TGF－β1的表達，并通過增加腎臟組織BMP－7 的表達從而拮抗TGF－ β1的致纖維化作用來實現(xiàn)的。本研究為黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液治療DN 提供了實驗依據(jù)。

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