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    炒酸棗仁對焦慮大鼠基底外側(cè)杏仁核神經(jīng)元信息編碼動(dòng)態(tài)變化的影響*

    2021-10-09 04:21:34華伊張正一王艷艷黃莉莉葉曉楠李廷利
    醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:曠場動(dòng)作電位酸棗仁

    華伊,張正一,王艷艷,黃莉莉,葉曉楠,李廷利

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150040)

    酸棗仁為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.Var.spinosae(Bunge)Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子,主治虛煩不眠、驚悸多夢等癥[1],酸棗仁在臨床的應(yīng)用普遍使用炒制品?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)炒酸棗仁能減少行為學(xué)測試中動(dòng)物的焦慮樣行為,具有一定的抗焦慮作用[2-3]。腦科學(xué)領(lǐng)域普遍認(rèn)為杏仁核(amygdala)是參與調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)的情緒、行為和生理反應(yīng)的一個(gè)重要腦區(qū)[4-5],杏仁核的基底外側(cè)核團(tuán)(basolateral amygdala,BLA)是焦慮調(diào)節(jié)過程中接收刺激信息傳入的主要部分[6]。杏仁核功能的改變已被認(rèn)為是焦慮癥的一個(gè)潛在條件[7-8],焦慮行為的增加與BLA區(qū)的過度活躍有關(guān)[9]。近年來,BLA區(qū)作為神經(jīng)回路中治療焦慮相關(guān)狀態(tài)和行為的關(guān)鍵成分被廣泛研究[10-12]。筆者在本文將行為學(xué)與神經(jīng)元在體同步電活動(dòng)相結(jié)合,進(jìn)行了焦慮大鼠的行為學(xué)及BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼動(dòng)態(tài)變化的研究,同時(shí)考察炒酸棗仁對其的干預(yù)作用。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(220±20)g,購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(黑)2013-004。動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)環(huán)境為通風(fēng)、避光、隔音、電磁屏蔽狀態(tài),并通過自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)進(jìn)行12 h/12 h明暗光照周期處理(每日7:00—19:00開啟照明,19:00至次日7:00關(guān)閉照明);室內(nèi)溫度:20~24 ℃;相對濕度:50%~60%;噪聲≤40 dB。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)適應(yīng)7 d,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所有大鼠不限制飲食和飲水。

    1.2藥物與試劑 酸棗仁,原產(chǎn)地山西,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為正品,依照文獻(xiàn)[13]方法,制備炒酸棗仁和炒酸棗仁水煎液;0.9%氯化鈉溶液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號(hào):170104D5);戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):WS20140104);義齒基托聚合物(上海貝瓊齒材有限公司,批號(hào):170308);義齒基托樹脂(上海新世紀(jì)齒科材料有限公司,批號(hào):20170408)。

    1.3儀器與設(shè)備 大鼠獨(dú)立通氣籠IVC(型號(hào):RU25H5,蘇州市蘇杭科技器材有限公司),分析天平(型號(hào):MS105,梅特勒-托利多儀器上海有限公司,感量:0.01 mg),大鼠曠場實(shí)驗(yàn)箱(100 cm×100 cm×40 cm,木制),標(biāo)準(zhǔn)腦立體定位儀(型號(hào):51600,美國Stoelting公司),在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng)(型號(hào):OPX-32D,美國Plexon公司),在體單軸微操作儀(型號(hào):IVM-1000,Microelettrica Scientifica China)。

    1.4在體多通道記錄電極的埋植 選取SD雄性大鼠20只,進(jìn)行電極埋植手術(shù)前,所有大鼠禁食8 h,不禁水。戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后,將其固定在標(biāo)準(zhǔn)腦立體定位儀上。根據(jù)《George Paxinos & Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜》(第3版),定位BLA區(qū)位置(坐標(biāo)AP 2.5~2.8 mm,ML 4.5~4.8 mm,DV 7.5 mm),將16(4×4)通道在體記錄電極(鉑銥合金,電極絲外周涂有絕緣層,直徑35 μm)埋置于大鼠的BLA區(qū)域,并用義齒基托樹脂將電極部分固定在動(dòng)物顱頂。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)4~5 d,于有機(jī)玻璃籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。

    1.5動(dòng)物的分組及給藥 將已植入電極并經(jīng)過術(shù)后恢復(fù)的大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組與炒酸棗仁組,每組10只。炒酸棗仁組每日灌胃給予大鼠炒酸棗仁水煎液(17.5 g·kg-1),模型對照組給予同等體積純化水,每日1次,連續(xù)7 d。

    1.6模型的制備及行為學(xué)測試 利用曠場實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠焦慮模型,每日給藥0.5 h后,將各組大鼠放入曠場箱內(nèi)底面中心,任其自由探索,利用動(dòng)物行為學(xué)采集和分析系統(tǒng),記錄10 min內(nèi)大鼠在曠場中的行為學(xué)表現(xiàn),每日1次,連續(xù)7 d。測試指標(biāo)為跨格次數(shù)、站立次數(shù)、進(jìn)入中央格次數(shù)、中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間(s)和總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(s),并以中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間除以總運(yùn)動(dòng)時(shí)間計(jì)算中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)。

    1.7神經(jīng)元在體放電信號(hào)的采集與處理 每日給藥0.5 h后,利用在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng),先采集各組大鼠在日常飼養(yǎng)環(huán)境中BLA區(qū)神經(jīng)元基礎(chǔ)放電信號(hào)(10 min),再在曠場實(shí)驗(yàn)的同時(shí)采集曠場環(huán)境中的BLA區(qū)神經(jīng)元曠場放電信號(hào)(10 min),每日1次,連續(xù)7 d。利用Offline Sorter軟件對采集到的神經(jīng)元放電信號(hào)進(jìn)行處理,過濾低頻放電和環(huán)境干擾放電,設(shè)置信噪比>3:1的信號(hào)為所需的動(dòng)作電位信號(hào),運(yùn)用主成分分析(principal component analysis,PCA)技術(shù)對提取出的動(dòng)作電位進(jìn)行分類處理,并計(jì)算每一類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆烹婎l率。將每只大鼠的每一類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢辉跁鐖鲋械姆烹婎l率減去其基礎(chǔ)放電頻率,得出的值定義為神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值,以此值進(jìn)行兩組大鼠在曠場中神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率變化的對比。

    2 結(jié)果

    2.1炒酸棗仁對焦慮大鼠行為學(xué)動(dòng)態(tài)變化的影響 隨著測試天數(shù)的增加,大鼠跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸下降,進(jìn)入中央格次數(shù)變化平穩(wěn),中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)逐漸上升。與模型對照組比較,炒酸棗仁組大鼠跨格次數(shù)在第5天明顯減少(P<0.05);站立次數(shù)在第2,4,5,7天明顯減少(P<0.05或P<0.01);總運(yùn)動(dòng)時(shí)間1~7 d均無明顯變化(P>0.05);進(jìn)入中央格次數(shù)在第1天明顯增加(P<0.01);中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間在第1~第3,第6天明顯增加(P<0.05或P<0.01);中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)在第1,第3、第5~第7天明顯增加(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

    ①與模型對照組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.01。

    2.2炒酸棗仁對焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼動(dòng)態(tài)變化的影響

    2.2.1大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆诸惣疤卣鲌D 在大鼠BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ㄐ翁卣鳛椋翰ㄩL較長,波峰后曲線下降緩慢。按照放電特征的不同,把在BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元分為Ⅰ、Ⅱ兩類(以下稱BLA區(qū)Ⅰ類神經(jīng)元為NeuronⅠ,Ⅱ類神經(jīng)元為NeuronⅡ)。NeuronⅠ的時(shí)長較長、振幅稍低,自相關(guān)圖中出現(xiàn)典型的尖峰、峰值后表現(xiàn)出快速的指數(shù)型下降;NeuronⅡ的時(shí)長較短、振幅較高,自相關(guān)圖中峰值后下降緩慢。兩類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹娔J降奶卣鲌D見圖2。

    A.NeuronⅠ動(dòng)作電位;B.NeuronⅡ動(dòng)作電位;a.波形圖;b.放電間隔直方圖;c.自相關(guān)圖。

    2.2.2焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率的動(dòng)態(tài)變化 與自身的基礎(chǔ)放電頻率相比,模型對照組和炒酸棗仁組大鼠在曠場中NeuronⅠ、NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率在1~7 d均有所增加;NeuronⅠ、NeuronⅡ在曠場中動(dòng)作電位放電頻率在1~2 d均有所增加,然后在2~7 d逐漸下降。NeuronⅠ與NeuronⅡ的放電數(shù)比例約為2:1。各組放電頻率直方圖見圖3。

    底部未畫黑線部分為大鼠處于日常飼養(yǎng)環(huán)境中的基礎(chǔ)放電,畫黑線部分為大鼠處于曠場環(huán)境中的曠場放電。

    2.2.3炒酸棗仁對焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率動(dòng)態(tài)變化的影響 由于與自身的基礎(chǔ)放電頻率相比,每只大鼠在曠場中的NeuronⅠ、NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率在1~7 d均有所增加,以神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值進(jìn)行兩組大鼠在曠場中動(dòng)作電位放電頻率變化的對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型對照組比較,炒酸棗仁組大鼠BLA區(qū)NeuronⅠ的動(dòng)作電位放電頻率增加值在第1,3~6天明顯減少(P<0.05或P<0.01),NeuronⅡ的動(dòng)作電位放電頻率增加值在第1,3,4,6,7天明顯減少((P<0.05或P<0.01)。見圖4。

    ①與模型對照組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.01。

    3 討論

    嚙齒動(dòng)物面對曠場提供的新環(huán)境時(shí),同時(shí)產(chǎn)生對空曠環(huán)境的恐懼和對新奇環(huán)境的探索欲[14],曠場實(shí)驗(yàn)利用這種矛盾沖突心理,在造成動(dòng)物焦慮情緒的同時(shí),進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性和焦慮水平的評估[15-16]。本文利用曠場實(shí)驗(yàn)制備大鼠焦慮模型,考察了連續(xù)7 d大鼠焦慮狀態(tài)下的行為學(xué)動(dòng)態(tài)變化。曠場行為學(xué)結(jié)果顯示,大鼠的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)指標(biāo),包括跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)時(shí)間,隨著測試時(shí)間的增加均逐漸減少。這一現(xiàn)象反映,隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加,大鼠對曠場環(huán)境逐漸適應(yīng)從而減弱它們對曠場的好奇心,降低大鼠的探索行為。

    曠場環(huán)境的中央格區(qū)域?qū)?dòng)物意味著潛在威脅,周邊格相較而言更安全,動(dòng)物在中央格區(qū)域的探究行為越多,代表動(dòng)物的焦慮程度越低[17]。連續(xù)7 d的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠的焦慮相關(guān)指標(biāo),包括中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間及中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%),隨著測試時(shí)間的增加而逐漸增加,表明動(dòng)物的焦慮程度逐漸減輕。大鼠的焦慮樣行為在初次接觸曠場時(shí)表現(xiàn)得更為強(qiáng)烈,而焦慮水平隨著重復(fù)接觸曠場而逐漸降低。這些觀察結(jié)果證明,動(dòng)物在反復(fù)暴露于曠場環(huán)境后表現(xiàn)出習(xí)慣化行為,與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致。HSIAO等[19]報(bào)道,連續(xù)進(jìn)行4 d的曠場測試,動(dòng)物在中心格區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間會(huì)逐漸減少,即反復(fù)接觸曠場后焦慮水平會(huì)增加,與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異,可能是因?yàn)槊刻靹?dòng)物進(jìn)行50 min的曠場實(shí)驗(yàn),而本文每日只測試10 min。因此,推測重復(fù)暴露于致焦慮環(huán)境中的時(shí)間過長不會(huì)建立習(xí)慣化行為,反而會(huì)造成焦慮程度增加。

    本實(shí)驗(yàn)在利用曠場實(shí)驗(yàn)制備大鼠焦慮模型的同時(shí),記錄連續(xù)7 d大鼠BLA區(qū)在體神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電及在曠場環(huán)境中曠場放電情況。本文采集到的BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏牟ㄐ翁卣鳛椴ㄩL較長,波峰后曲線下降緩慢,與文獻(xiàn)[20]報(bào)道結(jié)果一致。將在BLA區(qū)收集到的神經(jīng)元信號(hào)按動(dòng)作電位的波形和放電特征分為Ⅰ、Ⅱ兩類,與基礎(chǔ)放電頻率相比,所有大鼠的NeuronⅠ、NeuronⅡ在連續(xù)7 d的曠場環(huán)境中其動(dòng)作電位放電頻率均增加。這一現(xiàn)象表明,曠場環(huán)境改變大鼠BLA區(qū)的神經(jīng)元信息編碼,NeuronⅠ、NeuronⅡ均參與了曠場對動(dòng)物的焦慮加工。

    通過對BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值變化的觀察,發(fā)現(xiàn)NeuronⅠ、NeuronⅡ的動(dòng)作電位放電頻率在1~2 d均有所增加,然后在2~7 d持續(xù)下降。文獻(xiàn)[20]報(bào)道小鼠在連續(xù)3 d在曠場環(huán)境中BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率持續(xù)增加,本研究在1~2 d的結(jié)果與上述報(bào)道相似。這一現(xiàn)象提示,反復(fù)暴露于曠場環(huán)境中可能會(huì)引發(fā)BLA區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的短期增強(qiáng),提高BLA區(qū)神經(jīng)元的興奮性。本研究結(jié)果顯示從第2天開始BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率呈下降趨勢,與WANG等[20]研究存在差異,推測造成此差異的原因與在曠場中的暴露時(shí)間有關(guān)。WANG等[20]研究中動(dòng)物每日進(jìn)行30 min的曠場實(shí)驗(yàn),而本文每日只測試10 min,提示重復(fù)接觸致焦慮的曠場環(huán)境的時(shí)間過長不會(huì)建立習(xí)慣化行為,反而會(huì)造成動(dòng)物焦慮水平的逐漸增加,這與行為學(xué)結(jié)果的分析相同,但仍需進(jìn)一步的研究確定。本文第2~7天的結(jié)果證明,由于測試次數(shù)的不斷增加,大鼠建立習(xí)慣性行為,逐漸減輕在曠場中的焦慮程度,從而降低了BLA區(qū)神經(jīng)元的放電頻率,與行為學(xué)測試的結(jié)果一致。

    本研究在觀察焦慮大鼠行為學(xué)和神經(jīng)元在體活動(dòng)動(dòng)態(tài)變化的同時(shí),給予炒酸棗仁水煎液干預(yù),探討炒酸棗仁對其的影響作用。行為學(xué)結(jié)果顯示,炒酸棗仁減少大鼠在第5,7天的跨格次數(shù),并減少了第2,4,5,7天的站立次數(shù)。這一現(xiàn)象表明炒酸棗仁能降低重復(fù)暴露于曠場環(huán)境中大鼠的運(yùn)動(dòng)性和探索行為。同時(shí),炒酸棗仁增加大鼠第1天的進(jìn)入中央格次數(shù),增加第1~3,6天的中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間,并增加了第1,3,5~7天的中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間,表明炒酸棗仁能減輕曠場對大鼠造成的焦慮情緒。由于重復(fù)暴露于曠場環(huán)境中,大鼠建立了習(xí)慣化行為,焦慮水平隨著測試次數(shù)增加而降低,然而炒酸棗仁仍然能降低重復(fù)測試中動(dòng)物的焦慮水平,提示炒酸棗仁的抗焦慮效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了動(dòng)物自身的適應(yīng)能力。

    神經(jīng)元在體電活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,炒酸棗仁在第1,3~6天減少了大鼠NeuronⅠ動(dòng)作電位放電頻率增加值,在第1,3,4,6,7天減少了大鼠NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率增加值。表明炒酸棗仁通過抑制BLA區(qū)神經(jīng)元的過度放電改變BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼,拮抗曠場對大鼠造成的焦慮狀態(tài)。此外,在某些測試時(shí)間,炒酸棗仁能明顯減少BLA區(qū)神經(jīng)元電活動(dòng),但動(dòng)物的焦慮樣行為并沒有顯著變化。推測是由于炒酸棗仁的抗焦慮作用并不是由某一腦區(qū)的一類神經(jīng)元介導(dǎo),可能是多個(gè)腦區(qū)或多類神經(jīng)元共同作用的結(jié)果,具體原因還需進(jìn)一步研究。

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