蘋果過敏原Mald4蛋白抗原表位預(yù)測及交叉反應(yīng)分析①

夏宏林 何 穎 鄒澤紅 陶愛林 (廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/呼吸疾病國家重點實驗室變態(tài)反應(yīng)研究室/過敏反應(yīng)與臨床免疫重點實驗室，廣州510260)

蘋果屬于薔薇科植物，因其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及愉悅的風(fēng)味而被人們推薦為健康食品，雖然是一種健康食品，但在部分人群中會引起過敏反應(yīng)。據(jù)統(tǒng)計，歐洲大約有200萬人口對薔薇科水果過敏［1，2］。蘋果過敏主要臨床癥狀表現(xiàn)為口腔過敏綜合征、皮膚瘙癢、哮喘、蕁麻疹及過敏性鼻炎等，嚴(yán)重時可導(dǎo)致過敏性休克，甚至危及生命安全［2，3］。

蘋果過敏原主要有4種，Mald4蛋白是蘋果主要過敏原之一，在烘烤或經(jīng)胃腸道消化等條件下，理化性質(zhì)不穩(wěn)定。該過敏原蛋白與樺樹花粉過敏原Bet v 2有很高的同源性，存在交叉反應(yīng)，10% ～20%蘋果過敏患者血清的前纖維蛋白能與樺樹過敏患者血清中的IgE結(jié)合，在免疫交叉反應(yīng)中前纖維蛋白扮演非常重要的角色［4］。引起免疫交叉反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位(Antigenic epitope)，分為線性表位和構(gòu)象表位，其中T細(xì)胞僅能識別抗原遞呈細(xì)胞加工處理的線性表位，B細(xì)胞則可識別線性或構(gòu)象表位［5］。

目前對蛋白抗原表位預(yù)測主要集中在B細(xì)胞單參數(shù)預(yù)測，有一定的局限性，為此我們引入多參數(shù)綜合預(yù)測分析B/T細(xì)胞抗原表位，以便提高預(yù)測的準(zhǔn)確性［6，7］。通過對蘋果 Mald4蛋白 B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測及同源序列空間構(gòu)象對比，尋找含有相同/相似優(yōu)勢抗原表位區(qū)域位點，預(yù)測目的蛋白與其同源蛋白之間的交叉反應(yīng)性，為我們以后利用基因突變技術(shù)改造蘋果Mald4蛋白及其同源蛋白的過敏原性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蘋果Mald4蛋白(GenBank登錄號Q9XF41.1)，其氨基酸序列為:MSWQAYVDDHLMCEIEGNHLSAAAIIGHNGSVWAQSATFPQLKPEEVTGIMNDFNEPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGVVIRGKKGPGGVTVKKSTMALLIGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLIEQGL。

1.2 方法

1.2.1 Mald4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及特性分析 利用在線分析軟件HNN對蘋果Mald4蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。運(yùn)用SignaIP 3.0和TMHMM在線軟件分析該蛋白氨基酸序列信號肽和跨膜區(qū)域(表1)。

1.2.2 Mald4蛋白B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測 運(yùn)用Bcepred在線軟件預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，選取親水性好、抗原性強(qiáng)、可塑性好、分子可及性高的片段作為候選表位。采用DNAStar Protean軟件對目的蛋白抗原表位進(jìn)行預(yù)測，根據(jù)Kyte-Doolittle方案、Emini方案、Karplus-Schulz方案和 Jameson-Wolf方案，分別預(yù)測其蛋白的親水性、可及性、可塑性和抗原指數(shù)。在預(yù)測4種單參數(shù)中，取至少三個以上參數(shù)重疊區(qū)作為B細(xì)胞抗原表位候選區(qū)域。對上述二種軟件預(yù)測結(jié)果綜合分析，并兼顧二級結(jié)構(gòu)各參數(shù)，避免α-螺旋區(qū)，確定Mald4蛋白B細(xì)胞抗原表位區(qū)域;綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器NetMHCⅡ、NetMHCⅡpan、Propred、Syfpeithi預(yù)測能與MHCⅡ類分子結(jié)合的外源性抗原肽，選取9個滑動抗原肽，預(yù)測T細(xì)胞抗原表位親和力［8-10］。

表1 生物信息學(xué)在線軟件Tab.1 Bioinformatics online software

以上述預(yù)測Mald4蛋白B細(xì)胞抗原表位區(qū)域參數(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合T細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果，獲得B/T細(xì)胞共同抗原表位優(yōu)勢區(qū)域［11］。

1.2.3 Mald4蛋白抗原表位免疫交叉反應(yīng)預(yù)測利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blastp工具，搜索與蘋果Mald4蛋白同源性高的前纖維蛋白序列，運(yùn)用Clustal X1.83軟件對其同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并采用Mega 3.1軟件中的N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹。利用Swiss-Model在線軟件，對Mald4蛋白與其同源蛋白氨基酸序列空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，預(yù)測它們之間可能發(fā)生交叉反應(yīng)的空間位點。

2 結(jié)果

2.1 Mald4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及信號肽、跨膜區(qū)分析 運(yùn)用HNN在線軟件預(yù)測Mald4蛋白，結(jié)果顯示以無規(guī)則卷曲為主，分布在11個區(qū)域，高達(dá)53.44%;α-螺旋集中在 4 個區(qū)域，占 19.08%;伸展鏈主要分布在7個區(qū)域，占27.48%(表2)。利用在線軟件SignaIP 3.0分析Mald4蛋白的氨基酸序列，結(jié)果顯示該蛋白無信號肽。采用TMHMM軟件對Mald4蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)具有131個氨基酸殘基的Mald4蛋白無跨膜區(qū)。

2.2 Mald4蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測 通過Bcepred在線軟件對Mald4蛋白相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白B細(xì)胞抗原表位區(qū)域為40～46、53～61、85～95、107 ～113(表 3)。使用 DNAStar Protean軟件對Mald4蛋白相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明B細(xì)胞抗原表位的區(qū)域為16～18、40～48、52～61、85～95、107～114(表4)。綜合上述2種方法預(yù)測B細(xì)胞抗原表位區(qū)域參數(shù)，并兼顧二級結(jié)構(gòu)各參數(shù)預(yù)測結(jié)果，確定Mald4蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位區(qū)域為40～46、53～61、85～95、107～113。

表2 HNN預(yù)測Mald4二級結(jié)構(gòu)結(jié)果Tab.2 The result of Mald4 secondary structure predicted by HNN

2.3 T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測 利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Propred和Syfpeithi對Mald4蛋白T細(xì)胞抗原表位親和力進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示親和力高的評分區(qū)域為2～5、49～93(圖1);運(yùn)用 NetMHCⅡ、NetMHCⅡpan軟件對Mald4蛋白T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40～43、51～62、76～93、105～112為 T細(xì)胞抗原表位優(yōu)勢區(qū)域(圖2)。綜合上述T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，確定其T細(xì)胞共同抗原表位優(yōu)勢區(qū)域為51～62和76～93。

2.4 B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位綜合分析 結(jié)合上述Mald4蛋白B細(xì)胞與T細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果，對二者的重疊區(qū)域進(jìn)行擬合分析，確定Mald4蛋白B/T細(xì)胞共同表位優(yōu)勢區(qū)域為53～61和85～93。

2.5 Mald4蛋白抗原表位對比交叉反應(yīng)預(yù)測分析 以蘋果Mald4蛋白氨基酸序列為基礎(chǔ)，經(jīng)NCBIBlastP分析，并運(yùn)用Cluster X1.83軟件對其同源序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示蘋果Mald4蛋白與桃Pru p 4(Q8GT39.1)、甜櫻桃 Pru du 4(ACE80972)、草莓Fra a 4(POCOY3.1)、芒果 Man i3(ABD62998)的氨基酸序列同源性分別為95%、95%、91%、88%，都屬于前纖維蛋白家族(Profilin family)，而蘋果Mald4蛋白的抗原表位優(yōu)勢區(qū)域53～61和85～93，在這幾者之間是高度保守的(圖3)，因此它們之間發(fā)生交叉反應(yīng)的概率很高。采用Mega 3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)有二個明顯的分支，桃Pru p 4和甜櫻桃Pru du 4前纖維蛋白首先聚在一組，然后與蘋果Mald4、芒果Man i3、草莓Fra a 4前纖維蛋白聚在一起(圖4)。進(jìn)化比對發(fā)現(xiàn)，蘋果Mald4處于核心地位，與桃Pru p 4和甜櫻桃Pru du 4中前纖維蛋白親緣關(guān)系較近，具有較高保守遺傳穩(wěn)定性和演化趨同性，表明它們之間可能存在相似的功能。

表3 Bcepred預(yù)測Mald4蛋白B細(xì)胞表位Tab.3 Prediction results of the Mald4 B cell epitopes with Bcepred

表4 DNAStar預(yù)測Mald4蛋白B細(xì)胞表位Tab.4 Prediction results of the Mald4 B cell epitopes with DNAStar

圖1 Propred和Syfpeithi預(yù)測Mald4蛋白T細(xì)胞表位分析結(jié)果Fig.1 The results of the Mald4 protein T cell antigenic epitopes predicted by Propred and Syfpeithi

圖2 NetMHCⅡ和NetMHCⅡpan預(yù)測Mald4蛋白T細(xì)胞表位分析結(jié)果Fig.2 The results of the Mald4 protein T cell antigenic epitopes predicted by NetMHCⅡ and NetMHCⅡpan

圖3 不同物種前纖維蛋白優(yōu)勢抗原表位(方框表示區(qū))的對比分析Fig.3 Comparisons of dominant epitopes(Box said area)among different species profilins

圖4 蘋果Mald4蛋白與其它物種前纖維蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(N-J法)Fig.4 Phylogenetic tree of apple Mald4 protein and profilins from other species(N-J method)

圖5 不同物種蛋白空間構(gòu)象表位對比圖Fig.5 Conformational epitope comparison among different species proteins

利用Swiss-Model在線服務(wù)器，分別預(yù)測上述同源蛋白空間構(gòu)象表位所在區(qū)域，并用PyMOL 1.0軟件繪圖。結(jié)果表明蘋果Mald4蛋白與桃、甜櫻桃、草莓、芒果的前纖維蛋白空間構(gòu)象都含有4個α-螺旋，11個無規(guī)則卷曲，其中蘋果、桃和芒果的前纖維蛋白含有7個伸展鏈，甜櫻桃和草莓的前纖維蛋白含有6個伸展鏈(圖5)，雖然它們空間結(jié)構(gòu)略有差異，但是具有很高的相似性。這提示前纖維蛋白家族成員之間相似的空間構(gòu)象和功能在決定過敏原性特征方面可能起到重要作用。

綜合上述預(yù)測結(jié)果可知，蘋果Mald4蛋白與桃、甜櫻桃、草莓、芒果的前纖維蛋白同源性高，空間結(jié)構(gòu)相似，有較近的親緣關(guān)系，發(fā)生交叉反應(yīng)可能區(qū)域為53～61和85～93。

3 討論

近年來，生物信息學(xué)軟件在預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)特性等方面起到了非常重要的作用，已廣泛運(yùn)用于蛋白質(zhì)抗原表位的預(yù)測［12］。理想的抗原表位是兼有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的功能［13］，既可以通過刺激B細(xì)胞來產(chǎn)生抗原的特異性抗體，也可以與MHCⅡ類分子結(jié)合，通過抗原遞呈細(xì)胞把抗原信息遞呈給T淋巴細(xì)胞，引發(fā)T細(xì)胞的活化，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，為B細(xì)胞產(chǎn)生抗體提供支持。因此，引入兩種表位共預(yù)測的設(shè)想可提高抗原表位的預(yù)測準(zhǔn)確率。

目前對B細(xì)胞抗原表位預(yù)測主要是以線性表位為主，代表軟件有DNAStar、Bcepred等。由于不同預(yù)測軟件算法不同，預(yù)測的結(jié)果存在一些差異，所以綜合運(yùn)用不同軟件對多肽表位進(jìn)行多參數(shù)預(yù)測非常必要，對提高預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確性將起到一定作用［14］。

在預(yù)測B細(xì)胞抗原表位的同時，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測也非常重要［15］。對B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測時，應(yīng)選擇無規(guī)則卷曲的區(qū)域，避免 α-螺旋。因螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu)較為規(guī)則，化學(xué)鍵鍵能比較高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，多位于蛋白質(zhì)內(nèi)部形成構(gòu)象表位，不易與配體結(jié)合;而無規(guī)卷曲的區(qū)域多位于蛋白質(zhì)分子的表面，易形成線性表位，有利于與配體結(jié)合，容易嵌合抗體，成為抗原表位的可能性較大［5］。隨著生物信息學(xué)發(fā)展及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)充，應(yīng)用多參數(shù)綜合預(yù)測，已成為當(dāng)前抗原表位預(yù)測的主流［16］。基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)軟件對T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，本文選擇其中敏感性和特異性較高的軟件NetMHCⅡ、NetMHCⅡpan、Syfpeithi和Propred進(jìn)行綜合預(yù)測。

本研究以蘋果過敏原Mald4蛋白為基礎(chǔ)，為排除信號肽或跨膜區(qū)對抗原表位篩選的干擾，首先采用SignaIP 3.0和TMHMM在線軟件分析Mald4蛋白氨基酸序列的信號肽及跨膜區(qū)，結(jié)果表明該蛋白無信號肽和跨膜區(qū)。在B細(xì)胞表位的選擇上，綜合運(yùn)用Bcepred、DNAStar兩種軟件預(yù)測結(jié)果，選取親水性高、表面可及性強(qiáng)、抗原指數(shù)高以及柔韌性好的區(qū)域，兼顧該蛋白二級結(jié)構(gòu)，選取無規(guī)則卷曲區(qū)，避免 α-螺旋區(qū)，并結(jié)合 NetMHCⅡ、NetMHCⅡpan、Propred及Syfpeithi在線軟件預(yù)測T細(xì)胞抗原表位結(jié)果，最后得出優(yōu)勢抗原表位區(qū)域為53～61，85～93。此外，蘋果Mald4蛋白與桃、甜櫻桃、草莓、芒果的前纖維蛋白之間具有高度的同源性，并有非常相似的空間構(gòu)象，表明它們之間發(fā)生交叉反應(yīng)的概率很高。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，若超過80個氨基酸的蛋白質(zhì)，其序列的同源性大于35%，或有6個連續(xù)相同的氨基酸序列，則蛋白之間發(fā)生交叉反應(yīng)可能性就很高［17］。然而，Silvanovich 等［18］通過概率學(xué)研究表明，以8個或更少連續(xù)相同氨基酸序列來判定蛋白的交叉過敏反應(yīng)，只是一個隨機(jī)產(chǎn)生的結(jié)果，對致敏性評估不具備任何意義。由于序列相似性分析僅僅局限于氨基酸順序的比較，不能包括構(gòu)象表位分析，因此對同源蛋白保守區(qū)空間構(gòu)象進(jìn)行相似性分析，預(yù)測目的蛋白與其它同源蛋白之間是否會存在交叉反應(yīng)是很有意義的。

總之，本研究利用生物信息學(xué)方法，綜合多種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)軟件預(yù)測結(jié)果獲得蘋果Mald4蛋白T/B細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位。同時對蘋果Mald4蛋白及其同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對和空間構(gòu)象預(yù)測，獲得它們之間可能發(fā)生交叉反應(yīng)的優(yōu)勢表位區(qū)域。這為我們以后利用基因突變技術(shù)改造蘋果Mald4蛋白及其同源蛋白的過敏原性，指導(dǎo)并深入開展無過敏性或低過敏性蘋果制品以及表位疫苗的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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