FK506作為佐劑刺激Tfh細(xì)胞增強(qiáng)體液免疫水平的研究①

張婧瑤 黃波波 高文娟 楊司韻 孫昕然 張一雪 康友敏

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

Th細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)和輔助作用。Th細(xì)胞的前體細(xì)胞在不同抗原、共刺激分子、細(xì)胞因子等促進(jìn)分化的因素作用下，分化為不同類型的Th細(xì)胞而發(fā)揮作用。目前已知的有Th1、Th2、Th17、Treg、Th9、Tfh 等幾個(gè)亞群［1］。其中 Tfh是近年來發(fā)現(xiàn)的一群輔助B細(xì)胞的主要T細(xì)胞亞群，而Th1和Th2所分泌的細(xì)胞因子在B細(xì)胞活化和Ig類別轉(zhuǎn)換中只起到調(diào)節(jié)的作用［2］。Tfh細(xì)胞表達(dá)的CD40L和ICOS與B細(xì)胞上的CD40和ICOSL結(jié)合，以及通過分泌IL-21，在刺激B細(xì)胞的增殖、分化以及免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換中起著十分重要的作用［3，4］。IL-21在很大程度上加強(qiáng)了由 CD40與其配體CD40L結(jié)合誘導(dǎo)的B細(xì)胞的增殖，還調(diào)節(jié)Ig的生成及同型轉(zhuǎn)換［5］。Tfh細(xì)胞還表達(dá)CXCR5，使它在CXCL13的趨化下，被募集到淋巴濾泡并與B細(xì)胞共定位和相互作用。因此，CXCR5成為Tfh遷移、定位重要的“轉(zhuǎn)運(yùn)分子”，也是Tfh細(xì)胞重要的表面標(biāo)志。目前研究認(rèn)為Bcl-6是可能控制初始T細(xì)胞分化為Tfh的轉(zhuǎn)錄因子［6］。因此Tfh細(xì)胞相關(guān)分子(如ICOS或IL-21)的表達(dá)高低很可能與某些自身免疫性疾病或免疫缺陷疾病的發(fā)病有關(guān)［7］。

他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506，大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)，是繼環(huán)孢菌素A(CyclosporinA，CsA)之后國內(nèi)外器官移植術(shù)后臨床常規(guī)使用的新型免疫抑制劑之一［8］。FK506主要是與細(xì)胞性蛋白質(zhì)(FKBP12)結(jié)合，復(fù)合物與神經(jīng)鈣調(diào)磷酸酶特異性結(jié)合以抑制其活性，從而阻滯T淋巴細(xì)胞激活過程。FK506也可抑制IL-2、IL-3及IFN-β等淋巴因子的生成及IL-2受體的表達(dá)［9］。FK506對(duì)于Th細(xì)胞的研究多集中于二十世紀(jì)八十年代左右，而對(duì)于新近發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群研究很少。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)FK506能夠抑制Th17而刺激誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的產(chǎn)生，F(xiàn)K506對(duì)于Tfh細(xì)胞亞群研究還未見報(bào)道［10，11］。本文利用 FK506 作為卵清白蛋白(OVA)的佐劑對(duì)其刺激Tfh細(xì)胞增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫 雌性BALB/c小鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，6～8周齡，每組4只。OVA為Sigma產(chǎn)品。每只小鼠皮下注射OVA 100 μg，F(xiàn)K506(Astellas Ireland Co.，Ltd)10 μg，免疫三次，間隔2周。實(shí)驗(yàn)有3批小鼠按分組分別進(jìn)行免疫。

1.2 ELISA 在第三次免疫后7天，收集不同組小鼠血清進(jìn)行常規(guī)的ELISA檢測。具體方法如下，用5μg/ml OVA蛋白包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜;洗滌后用含5%脫脂牛奶封閉1小時(shí);洗滌后加入不同稀釋倍數(shù)的小鼠血清，37℃孵育1小時(shí);洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí);洗滌后 TMB顯色，酶標(biāo)儀OD450 nm/OD620 nm測定每孔光密度值。實(shí)驗(yàn)組血清與陰性對(duì)照OD比值大于等于2為陽性，此時(shí)的稀釋倍數(shù)即為抗體滴度。

1.3 細(xì)胞表面及細(xì)胞因子胞內(nèi)染色 在第三次免疫后7天，取小鼠脾臟，制備成單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，利用細(xì)胞因子胞內(nèi)染色的方法，1×106細(xì)胞加入PMA 50μg/ml和離子霉素100 ng/ml，同時(shí)加入莫能霉素(Golgisop產(chǎn)品)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，利用4%多聚甲醛固定，0.1%的皂素破膜后，加入熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CXCR5、IL-21的單克隆抗體(購于ebioscience)進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+)及分泌IL-21的Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+IL-21+)比例。同時(shí)取樣品利用抗小鼠B220和IL-21R熒光標(biāo)記單克隆抗體(購于ebioscience)進(jìn)行染色，檢測B細(xì)胞表達(dá)IL-21R(B220+IL-21R+)情況，結(jié)果以 B220+IL-21R+細(xì)胞占B220+細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

每批免疫小鼠各有1只，在第三次免疫后90天，取小鼠脾臟，制備成單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，加入熒光標(biāo)記的抗小鼠B220、CD27的單克隆抗體(購于 ebioscience)進(jìn)行染色、流式細(xì)胞儀檢測，B220+CD27+B細(xì)胞即為記憶性B細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 FK506作為佐劑顯著增強(qiáng)抗體水平 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，間隔2周。第三次免疫后7天，收集不同組小鼠血清進(jìn)行ELISA檢測血清中IgG水平。結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)K506/OVA免疫組IgG滴度最高為32 000，OVA單獨(dú)免疫組IgG滴度為16 000，表明FK506作為佐劑能夠顯著增強(qiáng)OVA特異性的抗體水平。

2.2 FK506作為佐劑刺激Tfh細(xì)胞產(chǎn)生IL-21 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，間隔2周。第三次免疫后7天，制備脾臟單細(xì)胞懸液進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子抗體染色，利用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CXCR5+細(xì)胞及CD4+CXCR5+IL-21+的比例，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)K506/OVA免疫組CD4+CXCR5+細(xì)胞的比例最高為 10.3%，顯著高于 OVA單獨(dú)免疫組(5.5%)。如圖3所示，F(xiàn)K506/OVA免疫組 CD4+CXCR5+IL-21+細(xì)胞的比例最高為10.2%，顯著高于OVA單獨(dú)免疫組(6.1%)。表明 FK506作為OVA的佐劑能夠增加Tfh細(xì)胞及其分泌的IL-21，可能直接作用于B細(xì)胞。

圖1 FK506對(duì)小鼠抗體水平的影響Fig.1 FK506 increased IgG level

圖2 FK506誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞產(chǎn)生Fig.2 The induction of Tfh cells by FK506

圖3 FK506刺激Tfh分泌IL-21Fig.3 FK506 stimulated IL-21 expression of Tfh cells

2.3 FK506作為佐劑對(duì)B細(xì)胞表達(dá)IL-21R的影響 Tfh細(xì)胞可以分泌IL-21，通過與B細(xì)胞表面的IL-21R作用刺激B細(xì)胞的增殖及活化，增強(qiáng)體液免疫水平。免疫后的小鼠取脾臟細(xì)胞進(jìn)行B細(xì)胞表面IL-21R的表達(dá)的檢測。如圖4結(jié)果表明FK506/OVA組B220+IL-21R+顯著高于OVA單獨(dú)免疫組，表明FK506可以增加B細(xì)胞表面IL-21R的表達(dá)。

2.4 FK506對(duì)記憶性B細(xì)胞的影響 B細(xì)胞被激活后轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞分泌抗體，而后大部分細(xì)胞凋亡，有一小部分B細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為記憶性B細(xì)胞，待再次遇到抗原后此部分記憶性B細(xì)胞很快被活化并分泌抗體。因此我們對(duì)FK506對(duì)記憶性B細(xì)胞的影響進(jìn)行了檢測。B220分子是B細(xì)胞的標(biāo)志，CD27+是記憶性B細(xì)胞的特征標(biāo)記，B220+CD27+B細(xì)胞即為記憶性B細(xì)胞。結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)K506/OVA組與OVA組相比，B220+CD27+表達(dá)顯著上升，表明FK506能夠增加記憶性B細(xì)胞的比例。

圖4 FK506增加B細(xì)胞表達(dá)IL-21RFig.4 FK506 increased IL-21R expression of B cells

圖5 FK506對(duì)記憶性B細(xì)胞的影響Fig.5 FK506 increased the percentage of B cells

3 討論

FK506是抑制機(jī)體免疫反應(yīng)的藥物，主要應(yīng)用于器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病及過敏反應(yīng)的治療［12，13］。FK506對(duì) T 細(xì)胞的抑制作用主要是通過抑制IL-2的產(chǎn)生，即抑制Th1細(xì)胞亞群;我們的前期研究發(fā)現(xiàn)FK506能夠影響Th17的產(chǎn)生及Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和功能［10，11］。FK506 對(duì)于 Tfh 細(xì)胞亞群研究還未見報(bào)道。本研究通過利用FK506作為模式OVA蛋白的佐劑，首次發(fā)現(xiàn)FK506能夠增加Tfh細(xì)胞亞群的比例并刺激IL-21的分泌，同時(shí)B細(xì)胞表面IL-21R表達(dá)顯著升高，表明Tfh細(xì)胞可能通過IL-21作用于B細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖能力及分泌抗體的水平。

疫苗免疫能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生具有抗原專一性的免疫反應(yīng)，是預(yù)防和治療疾病的重要和有效途徑。疫苗免疫能夠產(chǎn)生免疫記憶細(xì)胞，再次遇到抗原將會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量的擴(kuò)增特異性的免疫細(xì)胞，重要的是疫苗免疫能夠產(chǎn)生抗原特異性的免疫記憶細(xì)胞。本研究首次利用FK506作為模式OVA蛋白的佐劑，發(fā)現(xiàn)FK506能夠增強(qiáng)記憶性B細(xì)胞的比例，進(jìn)而增強(qiáng)疫苗的體液免疫水平。

綜上所述，F(xiàn)K506作為蛋白疫苗佐劑能夠刺激Tfh細(xì)胞分泌IL-21，作用于B細(xì)胞表面的IL-21R，刺激B細(xì)胞的增殖及活化，增強(qiáng)抗體水平，本研究為FK506研究拓展了思路。

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