紅曲霉菌株的分離鑒定及產紅曲色素發(fā)酵條件優(yōu)化

莊禧懿，儲衛(wèi)華,，馬興旺，朱 衛(wèi)

(1.中國藥科大學生命科學與技術學院,江蘇 南京 210009；2.南京日升康生物工程有限公司，江蘇 南京 211103)

紅曲霉菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)[1]。由紅曲菌接種于大米發(fā)酵得到的紅曲具有防腐、解毒、消食活血、健脾燥胃之功效[2]，同時，紅曲菌具有很強的產色素能力，紅曲色素作為天然色素應用于食品著色歷史悠久。紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素[3，4]。急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、慢性毒性試驗和致突變試驗表明，紅曲色素無毒副作用和致突變作用。隨著人們對合成食品添加劑和化學藥物對人體毒副作用的認識，世界各國掀起了食用綠色食品和使用天然藥物的熱潮，紅曲作為藥食兼用的天然制品，引起了極大的關注。與化工合成的色素相比，紅曲色素具有安全性高、穩(wěn)定性好、色調柔和、pH值穩(wěn)定、對蛋白質的著色力強且兼具抗菌性等特點，是一種具有悠久應用歷史的天然色素[5,6]。

作者從市售不同紅曲發(fā)酵產品中分離得到紅曲霉純培養(yǎng)菌株，根據形態(tài)學特征進行屬和種的鑒定，并對其發(fā)酵產紅曲色素工藝進行初步研究，為進一步發(fā)掘紅曲菌生物資源做了有益探索。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

市售功能性紅曲米粉，紅曲發(fā)酵飼料，紅腐乳等。

乳酸，無水乙醇。

高壓滅菌鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，超凈工作臺，顯微鏡，UV-2100 型分光光度計等。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；(2)孟加拉紅培養(yǎng)基；(3)麥芽汁液體培養(yǎng)基加乳酸調pH值2.5，加10%(體積分數，下同)乙醇。

形態(tài)鑒定平板培養(yǎng)基：(1)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(Wa培養(yǎng)基)；(2)察氏瓊脂培養(yǎng)基；(3)PDA培養(yǎng)基。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖90，蛋白胨30，KH2PO41.0，MgSO41.0，MnSO40.1，ZnSO40.1，pH值6.0。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉菌株的分離

稱取10.0 g 紅曲粉，加入到90 mL帶玻璃球的無菌生理鹽水中，振搖10 min，10倍梯度稀釋。吸取0.1 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～7 d，挑取單菌落轉移接種到新的分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，經反復分離純化得到較純的菌株，保藏。

1.3.2 菌株形態(tài)學觀察

將篩選的菌株的孢子劃線接種到形態(tài)鑒定培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)箱中，30 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察記錄各菌株的菌落形態(tài)。菌絲和孢子顯微結構的觀察采用插片培養(yǎng)法[7]，將接種好的培養(yǎng)皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取出蓋玻片觀察其菌絲結構、繁殖結構等形態(tài)特征。

1.3.3 液體發(fā)酵及色價測定

制作液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝到三角瓶中，裝液量為50 mL/250 mL，滅菌待用。無菌條件下將分離純化的菌株制成孢子懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1下搖床培養(yǎng)，考察接種量、培養(yǎng)基初始pH值等條件對產紅曲色素的影響。

紅曲色素的提取及其色價測定[8]：取發(fā)酵液5 mL，加入75%乙醇45 mL，靜置浸提4 h，過濾。濾液再以75%乙醇稀釋適當倍數后，以75%乙醇作空白對照，在波長510 nm處測定OD值。將OD值乘以稀釋倍數，即為紅曲色素色價(單位為 U·mL-1)。

2 結果與討論

2.1 產紅色素菌株的分離純化及形態(tài)

將不同的紅曲產品接種到分離培養(yǎng)基上，經過一段時間的培養(yǎng)，獲得了15株菌株， 其中一株肉眼可見產紅色素高于其它菌株，命名為RP-1。將RP-1孢子稀釋液涂布PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)，3～4 d 后可見白色團狀菌絲，7 d 后菌絲轉為紅色，紅色素擴散至整個培養(yǎng)基中(圖1)。

圖1 產紅色素霉菌在PDA培養(yǎng)基上的生長特征

2.2 RP-1形態(tài)學鑒定

在普通光學顯微鏡下觀察(圖2)，RP-1的菌絲呈不規(guī)則型分枝，多核，有橫隔，含油滴，無色透明或含深淺不一的紅色素，分生孢子呈球形，著生于菌絲及其分枝的頂端，孢子單生或鏈狀，閉囊殼球形，有柄。根據菌落及顯微形態(tài)，初步鑒定RP-1為紅色紅曲菌(Monascusruber)。

圖2 RP-1顯微形態(tài)特征(10×40)

2.3 培養(yǎng)條件對RP-1產紅曲色素的影響

2.3.1 接種量

接種量會對微生物生物量及代謝產物產生較大的影響。分別選用4種不同的接種量(1%、5%、10%和15%)進行實驗，經過7 d的培養(yǎng)，結果發(fā)現，隨著接種量的增加，紅曲色素色價提高，當接種量為15%時，其色價達到126.0 U·mL-1。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值

pH值是微生物生長和產物合成過程中重要的生理參數之一，對微生物酶活有顯著的影響，同時還會引起細胞膜透性以及菌體形態(tài)的變化，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收和代謝產物的分泌。培養(yǎng)基初始pH值分別設定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0進行實驗，結果發(fā)現，當培養(yǎng)基初始pH值為4.0時，紅曲色素色價為47.8 U·mL-1；當培養(yǎng)基初始pH值為5.0時，紅曲色素色價有所上升，但不明顯；當培養(yǎng)基初始pH值為6.0時，其色價最高，達132.0 U·mL-1；而當培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，其色價有所下降；當培養(yǎng)基初始pH值為8.0時，其色價為115.6 U·mL-1。這可能跟真菌的適宜生長pH值有關。因此，紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產紅曲色素的培養(yǎng)基最佳初始pH值為6.0。

2.3.3 討論

后家衡等[9]研究表明，接種量為5.0%、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時間為72 h、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時，3 株紅曲霉中以Mg 菌株產色素最高，并在以番薯粉為碳源的培養(yǎng)基中色素產量最高；而劉德華等[10]研究表明，5%～20%的接種量、培養(yǎng)基初始pH值7.0最有利于紅曲色素的合成。他們的研究結果與本研究有所差別，表明紅曲霉不同菌株產色素能力有著很大差異，優(yōu)化發(fā)酵條件可以顯著提高色素色價，因此進行色素高產菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化是十分有必要的。

3 結論

從市售紅曲發(fā)酵產品中成功分離得到15株紅曲霉純培養(yǎng)菌株，其中一株肉眼觀察高產紅色素，通過形態(tài)特征觀察，初步鑒定該菌株為紅曲屬(Monascus)中的紅色紅曲菌(Monascusruber),命名為RP-1。下一步有必要對分離到的RP-1進行18S rDNA、GC含量測定以進行準確鑒定。

對紅曲霉RP-1的液體搖瓶發(fā)酵工藝進行了初步研究，結果發(fā)現，接種量以及培養(yǎng)基初始pH值等發(fā)酵參數對紅曲霉RP-1液體發(fā)酵產紅曲色素色價有影響，接種量為15%、培養(yǎng)基初始pH值為6.0時，最有利于紅曲色素的合成。

參考文獻：

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[10] 劉德華，劉代喜，丁海洋,等.紅曲霉JR液體發(fā)酵產紅曲色素的工藝研究[J].中國釀造，2010，(5)：59-61.