野生石蒜中石蒜堿和加蘭他敏的分離研究

熊海蓉，李 霞，文祝友，趙明明，熊遠(yuǎn)福，劉 英

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128)

石蒜屬(Lycoris)植物的主要活性成分為生物堿類，其中石蒜堿和加蘭他敏具有良好的藥理作用。目前我國石蒜的開發(fā)和應(yīng)用十分有限。石蒜堿(Lycorine)，是一種異喹啉類生物堿，為吡咯駢啡星啶的衍生物[1～3]。加蘭他敏(Galanthamine或Galantamine)，是一種四環(huán)生物堿，在藥理上是一種具有可逆作用的膽堿酯酶抑制劑[4,5]。

目前，對石蒜所含生物堿的臨床藥用研究很多[1，4，6]。據(jù)報道[7]，生物堿的分離大多數(shù)采用高速逆流色譜法(HSCCC)。高速逆流色譜法分離石蒜提取物中石蒜堿和加蘭他敏，與溶劑萃取法相比，純度更高，可以大量連續(xù)操作；與柱層析法相比，分離過程中無需添加其它輔助物質(zhì)，且分離效果更佳。目前，國內(nèi)尚未見到用高速逆流色譜法同時分離石蒜中石蒜堿和加蘭他敏的報道。作者在此運(yùn)用高速逆流色譜法同時分離野生石蒜提取物中石蒜堿和加蘭他敏，探索分離石蒜堿和加蘭他敏的條件，以期為野生石蒜主要藥用成分的綜合利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

野生石蒜，湖南九嶷山；大孔樹脂HPD(工業(yè)級)，滄州寶恩化工有限公司。

石蒜堿標(biāo)樣、加蘭他敏標(biāo)樣(純度≥94%)，株洲惠心生物化工有限公司；所用試劑均為分析純。

TBE-300A型高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司；1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 粗提物的純化

準(zhǔn)確稱取約0.5 g野生石蒜粗提物[6]，用100 mL無水乙醇溶解，再加300 mL超純水配成母液。向柱中加稀釋后的乙醇(無水乙醇與水的體積比為1∶3)排氣泡。將母液上柱，上樣體積為9 BV，流速為2 BV·h-1，用處理過的大孔樹脂吸附完全；再用5 BV超純水洗滌，然后用10 BV 70%乙醇洗脫，流速為2 BV·h-1。收集解吸液，得到純化后的石蒜堿和加蘭他敏的乙醇溶液[2,6]，將溶液濃縮至小體積，再冷凍蒸發(fā)干燥，得到固態(tài)石蒜樣品。

1.3 溶劑體系的選擇

HSCCC法分離溶劑體系應(yīng)滿足以下條件：不造成樣品的分解與變性；有足夠高的樣品溶解度；樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)；固定相能實現(xiàn)足夠高的保留值等。綜合以上條件，選擇表1中幾種溶劑體系進(jìn)行實驗。

表1 溶劑體系

首先采用薄層色譜法在硅膠板上進(jìn)行薄層色譜實驗，計算各溶劑體系的Rf值。再稱取1 mg左右的石蒜樣品分別溶于10 mL各溶劑體系的上相中，使其充分溶解后進(jìn)行HLPC檢測，計算分配系數(shù)K(K=上相峰面積/下相峰面積)。

1.4 分離和檢測方法

根據(jù)最佳溶劑體系配比配制2000 mL溶液，靜置隔夜分層，超聲脫氣0.5 h。準(zhǔn)確稱取17.8 mg大孔樹脂純化后的石蒜樣品,用3 mL下相溶液溶解，超聲溶解完全，即得試樣。待儀器穩(wěn)定后，將試樣注入色譜儀中，同時打開色譜工作站進(jìn)行檢測。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定石蒜堿、加蘭他敏的含量。

HSCCC色譜條件：流動相體積流量為2.5 mL·min-1；轉(zhuǎn)速為850 r·min-1；波長為280 nm；TC-1050型恒溫循環(huán)器溫度為25 ℃。

HPLC色譜條件[8]：色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速0.5 mL·min-1；柱溫20 ℃；檢測波長290 nm；流動相為磷酸緩沖溶液(pH值6.86)-乙腈(85∶15，體積比)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC最佳溶劑體系

各溶劑體系的Rf和K值見表2。

表2 各溶劑體系的Rf和K

如果分離組分的Rf值>0.5，說明此條件適用于分離低極性的物質(zhì)。而且弱極性的有機(jī)相適于作流動相；對于極性較大的溶質(zhì)Rf<0.5，則極性強(qiáng)的那一相可以作為流動相。

一般而言，對HSCCC最適合的K值范圍是0.5～2。當(dāng)K值<0.5時，出峰時間太快，峰之間的分離度較差；當(dāng)K值>2時，出峰時間太長且峰形太寬，分離效果不好。

根據(jù)表2結(jié)果，選用3#溶劑體系即正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶7∶3.5∶6.5(體積比)體系作為高速逆流色譜法的最佳溶劑體系。

2.2 HSCCC分離圖譜(圖1)

圖1 石蒜中生物堿的HSCCC圖譜

從圖1可知，除了含有石蒜堿和加蘭他敏外，大孔樹脂純化后的石蒜樣品中還有其它生物堿，3個峰雖未徹底分開，但分離效果已很明顯。其中，A峰出峰時間為63.15～73.22 min，B峰出峰時間為76.21～86.89 min，C峰出峰時間為96.83～108.08 min，分別收集峰A、B和C所對應(yīng)的組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。

2.3 石蒜堿與加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

準(zhǔn)確稱取石蒜堿標(biāo)準(zhǔn)品0.0030 g、加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品0.0021 g，加5 mL色譜純甲醇溶解完全，進(jìn)行HPLC檢測，進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果見圖2。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

從圖2可知，石蒜堿出峰時間在6.4 min左右，加蘭他敏出峰時間在13.9 min左右。在該HPLC條件下，兩種物質(zhì)能同時檢測。

2.4 HSCCC分離后石蒜堿與加蘭他敏的HPLC圖譜

收集HSCCC分離出的組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，濃縮至小體積，冷凍蒸發(fā)后用色譜純甲醇溶解完全，分別進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 HSCCC中組分Ⅰ(a)、Ⅱ(b)、Ⅲ(c)的HPLC圖譜

圖3a中組分Ⅰ的出峰時間為6.5 min左右，對照標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可知，此峰為石蒜堿的色譜峰。表明HSCCC在63.15～73.22 min時間段內(nèi)分離出的物質(zhì)為石蒜堿；測得其純度為95.36%。

圖3b中組分Ⅱ的出峰時間為13 min左右，對照標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可知，此峰為加蘭他敏的色譜峰。表明HSCCC在76.21～86.89 min時間段內(nèi)分離出的物質(zhì)為加蘭他敏；測得其純度為91.67%。

由圖3c可看出，HSCCC在96.83～108.08 min時間段內(nèi)分離出的物質(zhì)不純，是純化后除石蒜堿和加蘭他敏外的其它物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用高速逆流色譜法分離野生石蒜中石蒜堿和加蘭他敏的最佳溶劑體系為：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶7∶3.5∶6.5(體積比)，分離后石蒜堿的純度為95.36%，加蘭他敏的純度為91.67%。HSCCC法可同時將石蒜總堿中石蒜堿和加蘭他敏分離，分離效果良好，是分離石蒜屬植物中生物堿較理想的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙明明,熊海蓉,李霞,等.石蒜屬植物中石蒜堿的研究進(jìn)展[J].河南化工,2010,27(10):25-28.

[2] 李霞,熊遠(yuǎn)福,文祝友,等.大孔吸附樹脂純化石蒜中石蒜堿[J].應(yīng)用化學(xué),2009,26(3):325-328.

[3] 趙明明,熊海蓉,李霞.石蒜中石蒜堿的超聲波提取研究[J].化學(xué)與生物工程,2011,28(8):33-35.

[4] 李霞,熊遠(yuǎn)福,蔣利華,等.石蒜屬植物中加蘭他敏的化學(xué)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006，32(1):57-60.

[5] 李子璇,江海,曹小勇,等.石蒜植株中加蘭他敏的分布與含量測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,(3)：290-292.

[6] 李霞,熊遠(yuǎn)福,蔣利華,等.一步法提取石蒜中加蘭他敏和石蒜堿[J].化工進(jìn)展,2008，27(6):904-907.

[7] 耿敬章,徐福星.生物堿的生理功能及其提取分離研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2007,10(4):44-46.

[8] 李霞,熊海蓉,蔣利華,等.HLPC法同時測定石蒜中加蘭他敏和石蒜堿[J].應(yīng)用化學(xué),2010,27(11)：362-364.