小劑量氯胺酮對嗎啡耐受細胞δ阿片受體及NMDA受體2B亞型表達的影響

張秀寧，文 迪，徐貫杰，孟雁欣，叢 斌，趙申明，馬春玲

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科，河北石家莊 050051;2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊 050017)

嗎啡(morphine，Mor)廣泛用于疼痛治療，尤其是晚期癌痛患者，但長期應(yīng)用可產(chǎn)生嗎啡耐受影響其鎮(zhèn)痛效果，其機制可能與阿片受體脫敏和內(nèi)化有關(guān)［1－2］。NMDA受體高表達在嗎啡耐受中亦發(fā)揮重要作用［3］。發(fā)現(xiàn) NMDA受體拮抗劑氯胺酮(ketamine，K)等具有緩解嗎啡耐受的作用已近20年，臨床研究［4］與動物研究［5－6］關(guān)于小劑量氯胺酮防止嗎啡耐受發(fā)生有大量報道，然而此作用的分子機制迄今尚未闡明。本研究擬在建立嗎啡耐受細胞模型基礎(chǔ)上，通過觀察小劑量氯胺酮對δ阿片受體1(DOR-1)和NMDA受體2B亞型(NR2B)的影響，初步探討氯胺酮調(diào)節(jié)嗎啡耐受的受體機制。

1 材料與方法

1.1 材料 PC-12(上海拜力生物科技有限公司)，DMEM/高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清、青/鏈霉素、EDTA-胰酶(美國 PA公司)，鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)，鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司)，TRIzol(美國 Invitrogen公司)，DEPC(美國 Invitrogen公司)，PrimeScriptTMRT regent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMPCR 試劑盒(日本TaKaRa公司)，LanceTM384cAMPKit(美國PerkinElmer公司)，PCR 儀、7500型 Real-Time PCR儀(美國AB公司)，多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及嗎啡耐受細胞模型建立 PC-12細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1鏈霉素的DMEM/高糖培養(yǎng)基中，在37℃下持續(xù)通入5%CO2和95%空氣進行培養(yǎng)。將細胞按4×108cells·L－1的密度接種在50 ml培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后細胞貼壁面積約80% ～90%，細胞傳代于6孔板，細胞密度2×108cells·L－1，每孔2 ml培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁面積約70%，更換為不含胎牛血清的培養(yǎng)基，加入不同因素進行處理。

參照文獻［7］建立嗎啡耐受細胞模型，加入10 μmol·L－1嗎啡作用48 h，以cAMP含量增加檢驗?zāi)Ｐ徒⑹欠癯晒Α?/p>

1.3 cAMP含量測定 10 μmol·L－1嗎啡分別作用細胞0.5、6、24和48 h，1 ×PBS沖洗細胞2 次，加入 Versene's 液(g·L－1，EDTA 0.37，NaCl 8.00，KCl 0.20，KH2PO40.20，Na2HPO41.15，葡萄糖 0.20，pH 7.4)，室溫孵育3～5 min后收集細胞，4℃、300×g離心5 min，棄上清。1×HBSS液(g·L－1，CaCl20.14，KCl 0.40，KH2PO40.06，MgCl2·6 H2O 0.10，MgSO4·7 H2O 0.10，NaCl 8.00，NaHCO30.35，葡萄糖1.00，Na2HPO4·7 H2O 0.09，pH 7.4)沖洗1 次，1×HBSS液重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×109cells·L－1。使用時間分辨熒光免疫分析cAMP試劑盒測定細胞內(nèi)cAMP含量。

1.4 DOR-1和NR2B表達測定 應(yīng)用Real-Time PCR檢測PC-12細胞DOR-1和NR2B表達:1×PBS沖洗細胞兩次，加入TRIzol提取細胞總RNA，各組取500 ng總RNA經(jīng)PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序:37℃ 15 min，85℃ 5 s.Premix Ex TaqTM試劑盒擴增目的基因，所用引物由上海生物技術(shù)工程公司合成。引物序列:DOR-1(上游 5'-CAACGTGCTCGTCATGTTTGG-3'，下 游 5'-CAGGTACTTGGCGCTCTGGAA-3');NR2B(上游5'-TGCACAATTACTCCTCGACG-3'，下 游 5'-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3');GAPDH(上游5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'，下 游 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3');擴增條件:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。GAPDH基因為內(nèi)參基因?！鳌鰿t法分析目的基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡鎮(zhèn)痛/耐受PC-12細胞模型的建立 參照文獻［7］成功建立嗎啡耐受細胞模型，以10 μmol·L－1嗎啡處理 PC-12 細胞 0.5、6、24、48 h 后測量細胞內(nèi)cAMP含量。處理0.5 h組細胞內(nèi)cAMP含量(2.23±0.26)pmol·L－1明顯低于對照組(3.05±0.32)pmol·L－1(P=0.008)。48h 組細胞內(nèi)cAMP含量(3.86±0.29)pmol·L－1高于對照組(P=0.021)。6 h 組(2.94 ±0.76)pmol·L－1和 24 h組(3.10 ±0.42)pmol·L－1，與對照組相比差異均無顯著性(P=0.698和P=0.868)。見Fig 1。

2.2 不同劑量氯胺酮作用PC-12細胞48 h cAMP含量 不同劑量氯胺酮(0.5、5、50 μmol·L－1)組cAMP含量(3.32±0.50)、(3.22±0.30)、(3.25±0.25)pmol·L－1與對照組(3.31 ±0.40)pmol·L－1相比差異無顯著性(P=0.99、P=0.73、P=0.81)，見Fig 2。

2.3 氯胺酮聯(lián)合嗎啡作用細胞48 h cAMP含量10 μmol·L－1嗎啡單獨作用 cAMP 含量(4.53 ±0.40)pmol·L－1高于對照組(3.73 ± 0.25)pmol·L－1(P=0.005)。嗎啡與 0.5 μmol·L－1氯胺酮聯(lián)合作用cAMP含量(2.86±0.18)pmol·L－1明顯低于對照組(P=0.013)和嗎啡組(P=0.001)。嗎啡與5、50 μmol·L－1氯胺酮聯(lián)合作用 cAMP 含量分別為(3.44 ±0.33)pmol·L－1和(3.64 ±0.35)pmol·L－1，均明顯低于嗎啡組(P=0.002，P=0.006)，與對照組相比差異無顯著性(P=0.478，P=0.938)，見Fig 3。

Fig 1 cAMP levels in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine for different times

Fig 2 cAMP levels in PC-12 cells treated with different concentrations of ketamine for 48 hours

2.4 嗎啡耐受細胞模型DOR-1的表達 應(yīng)用Real-Time PCR檢測細胞DOR-1受體表達，結(jié)果顯示:嗎啡作用細胞48 h后與對照組相比表達下降(0.55±0.11)倍(P=0.005)，單獨應(yīng)用 0.5 μmol·L－1氯胺酮組(0.98±0.82)與對照組相比差異無顯著性(P=0.99)，與對照組相對表達值為0.98±0.82。0.5 μmol·L－1氯胺酮與 10 μmol·L－1嗎啡聯(lián)合作用(1.03±0.02)與嗎啡組(0.55±0.11)相比DOR-1表達明顯增高(P=0.003)，與對照組相比差異無顯著性(P=0.840)，見Fig 4。

Fig 3 cAMP levels in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)in the presence and absence of different concentrations(K，μmol·L-1)of ketamine for 48 hours

Fig 4 Level of DOR-1 expression in PC-12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)，0.5 μmol·L-1ketamine(K)，and 10 μmol·L-1morphine plus 0.5 μmol·L-1ketamine

2.5 嗎啡耐受細胞模型NR2B的表達 應(yīng)用Real-Time PCR 檢測 NR2B 表達結(jié)果顯示，10 μmol·L－1嗎啡作用細胞48 h，NR2B表達(18.09±3.69)較對照組(1.00±0.01)增高(P=0.016)，單獨應(yīng)用0.5 μmol·L－1氯胺酮組(1.36 ±0.61)與對照組相比差異無顯著性(P=0.99)。嗎啡聯(lián)合應(yīng)用0.5 μmol·L－1氯胺酮組NR2B表達(2.49±0.83)與嗎啡組相比明顯降低(P=0.017)，與對照組相比差異也有顯著性(P=0.042)，見 Fig 5。

3 討論

嗎啡是目前臨床癌痛患者常用的鎮(zhèn)痛藥，但長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐受而嚴重影響其鎮(zhèn)痛效果。在單獨使用嗎啡無效的癌痛患者中，輔以小劑量(肌注小于2 mg·kg－1、靜脈或硬膜外注射小于 1 mg·kg－1或靜脈持續(xù)輸注≤20 μg·kg－1·min－1)氯胺酮治療，可使62%的患者得到長達8周的疼痛改善［8］，而小劑量氯胺酮本身無明顯鎮(zhèn)痛作用。其相關(guān)分子機制尚不清楚，尤其NMDA受體亞單位和阿片δ受體在其中的相關(guān)作用報道甚少。

Fig 5 Level of NR2B expression in PC12 cells treated with 10 μmol·L-1morphine(Mor)，0.5 μmol·L-1ketamine(K)，and 10 μmol·L-1morphine plus 0.5 μmol·L-1ketamine

目前，普遍認為嗎啡與阿片受體結(jié)合，主要通過抑制AC-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［9］，嗎啡長時程處理導(dǎo)致抑制作用降低，引起細胞內(nèi)AC-cAMP通路適應(yīng)性上調(diào)，cAMP含量增加，因此通常以cAMP是否明顯增加作為嗎啡耐受細胞模型建立的依據(jù)［9－10］。本實驗以10 μmol·L－1嗎啡處理 PC-12細胞48 h后cAMP含量明顯升高，提示嗎啡耐受細胞模型建立成功。

阿片受體主要包括μ、δ、κ等亞型，有研究表明［11］，將小鼠δ受體1(DOR-1)基因外顯子敲除后，應(yīng)用DOR特異受體激動劑D青霉胺2、D青霉胺5內(nèi)啡肽(［D-Pen2，D-Pen5］enkephalin，DPDPE)進行鎮(zhèn)痛測試，結(jié)果顯示DPDPE耐受缺失，表明阿片耐受形成與DOR-1相關(guān)。而小劑量氯胺酮防止嗎啡耐受發(fā)生是否和DOR-1相關(guān)未見報道，本實驗結(jié)果證實嗎啡耐受細胞DOR-1表達較對照組下降，而小劑量氯胺酮與嗎啡聯(lián)合作用可防止DOR-1的下調(diào)，提示小劑量氯胺酮可通過調(diào)節(jié)DOR-1表達緩解嗎啡耐受。

NMDA受體是谷氨酸特異性離子通道受體，由NR1、NR2(A、B、C、D)和 NR3(A、B)組成［12］。氯胺酮是非特異性NMDA受體拮抗劑，Bajo等［13］發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受SD大鼠中，腦伏核和中央杏仁核NR1和NR2B表達升高，而NR2A表達無變化，表明嗎啡長時程作用引起耐受過程有NMDA受體參與，但各亞單位作用不同，且NR2B在傷害性感受發(fā)生和維持中有重要作用［12］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受發(fā)生時NR2B表達上調(diào)，與 Bajo等［13］在體研究結(jié)果一致，而小劑量氯胺酮與嗎啡聯(lián)合作用可使上調(diào)的NR2B下降，提示小劑量氯胺酮可通過調(diào)節(jié)NR2B表達緩解嗎啡耐受。

以往對DOR-1和NR2B在小劑量氯胺酮抑制嗎啡耐受機制的研究多在整體水平進行，本實驗首次在細胞水平同時觀察DOR-1和NR2B在此過程的變化，為進一步探討其受體后信號傳導(dǎo)機制提供了實驗依據(jù)。綜上，小劑量氯胺酮可防止嗎啡鎮(zhèn)痛耐受發(fā)生，其受體機制可能與阻止嗎啡引起的細胞DOR-1表達下調(diào)及NR2B表達上調(diào)有關(guān)。

［1］ Christie M J.Cellular neuroadaptations to chronic opioid:tolerance，withdrawal and addition［J］.Br J Pharmacol，2008，154(2):384－96.

［2］ Martini L，Whistler J L.The role of muopioid receptor desensitization and endocytosis in morphine tolerance and dependence［J］.Curr Opin Neurobiol，2007，17(5):556 － 64.

［3］ 閻雪斌，黃曉玲，黃 東.NMDA受體和NOS參與骨癌痛小鼠嗎啡耐受的形成［J］.中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，35(5):458－63.

［3］ Yan X B，Huang X L，Huang D.NMDA receptor and NOS in morphine tolerance in mice with bone cancer［J］.J Central South Univ(Med Sci)，2010，35(5):458 －63.

［4］ Nesher N，Serovian I，Marouani N，et al.Ketamine spares morphine consumption after transthoracic lung and heart surgery without adverse hemodynamic effects［J］.Pharmacol Res，2008，58(1):38－44.

［5］ Holtman J R Jr，Crooks P A，Johnson-Hardy J，et al.Interaction between morphine and norketamine enantiomers in rodent models of nociception［J］.Pharmacol Biochem Behav，2008，90(4):769 －77.

［6］ Galeotti N，Stefano G B，Guarna M，et al.Signaling pathway of morphine induced acute thermal hyperalgesia in mice［J］.Pain，2006，123(3):294 －305.

［7］ 臧夢維，孟愛民，孫 越，等.嗎啡耐受和依賴第二信使分子和阿片受體變化及谷氨酸受體的關(guān)系［J］.中華麻醉學(xué)雜志，1999，19(7):406 －9.

［7］ Zang M W，Meng A M，Sun Y，et al.The relationship between changes of some second messengers and opioid receptor as well as activities of glutamate receptor in morphine tolerance and dependence［J］.Chin J Anesthesiol，1999，19(7):406 －9.

［8］ Hocking G，Visser E J，Schug S A，et al.Ketamine:does life begin at 40［J］?Pain Clin Updates，2007，XV(3):15 －7.

［9］ Levitt E S，Purington L C，Traynor J R.Gi/o-coupled receptors compete for signaling to adenylyl cyclase in SH-SY5Y cells and reduce opioid-mediated cAMP overshoot［J］.Mol Pharmacol，2011，79(3):461－7.

［10］ Gintzler A R，Chakrabarti S.The ambiguities of opioid tolerance mechanisms:barriers to pain therapeutics or new pain therapeutic possibilities［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，325(3):709 － 13.

［11］ Zhu Y，King M A，Schuller A G，et al.Retention of supraspinal delta-like analgesia and loss of morphine tolerance in delta opioid receptor knockout mice［J］.Neuron，1999，24(1):243 －52.

［12］ Vicini S，Wang J F，Li J H，et al.Functional and pharmacological differences between recombinant N-methyl-D-aspartate receptors［J］.J Neurophysiol，1998，79(2):555 －66.

［13］ Bajo M，Crawford E F，Roberto M，et al.Chronic morphine treatment alters expression of N-methy-D-aspartate receptor subunits in the extended amygdale［J］.J Neurosci Res，2006，83(4):532 － 7.