碳酸酐酶抑制劑甲苯磺烷唑胺血漿蛋白結(jié)合的特征

王金達(dá)，石永平，潘志遠(yuǎn)，崔文玉，張雁芳，汪 海

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850;2.北京賽德維康醫(yī)藥研究院，北京 100039)

高原低氧等因素引起的急性高原反應(yīng)是對(duì)高原工作者和進(jìn)入高原人群的健康的極大的威脅。碳酸酐酶抑制劑醋氮酰胺是美國(guó)FDA批準(zhǔn)正式用于防治急性高原反應(yīng)的藥物，但其不良反應(yīng)發(fā)生率高，嚴(yán)重影響人體的作業(yè)能力［1］。甲苯磺烷唑胺(P-8)是擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型化學(xué)結(jié)構(gòu)碳酸酐酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)它可以抑制碳酸酐酶Ⅱ的活性，明顯提高小鼠耐低氧能力，其效價(jià)和效能均優(yōu)于醋氮酰胺［2］。

藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物代謝動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一，本實(shí)驗(yàn)采用平衡透析法考察了甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血漿蛋白結(jié)合率，為進(jìn)一步開展甲苯磺烷唑胺的藥動(dòng)學(xué)研究提供參考，并為臨床合理設(shè)計(jì)甲苯磺烷唑胺給藥方案提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 戴安高效液相色譜儀及色譜工作站(戴安公司，美國(guó));BP211D型分析天平(Sartorius);TDX-1型漩渦混合器 (通達(dá)科技);BF-2000M型氮?dú)獯蹈蓛x(八方世紀(jì));恒溫培養(yǎng)箱(Forma ScientificⅡ，F(xiàn)orma);透析袋(D25mm，截留范圍8000-14000，進(jìn)口分裝)。

1.2 藥品與試劑 甲苯磺烷唑胺(自制，純度＞98%);非那西丁(Sigma試劑公司，純度＞98%);甲醇(色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑有限公司);冰醋酸、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉均為分析純;水為millipore去離子水;人血漿由中國(guó)人民解放軍307醫(yī)院提供。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，♀♂各半，180～220 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);保護(hù)住為 Zorbax Eclipse Plus C18(12.5 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.1%冰醋酸:甲醇(V∶V)=42∶58;柱溫為25℃;流速為1 ml·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm;進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 樣品處理

2.2.1 透析內(nèi)液 取大鼠或人血漿樣品150 μl于1.5 ml的離心管中，加入10 mg·L－1非那西丁溶液(內(nèi)標(biāo))20 μl，渦旋振蕩器上振蕩30 s后，加入二氯甲烷1 ml，渦旋振蕩器上振蕩3 min。4 000 r·min－1離心5 min，移去上層液體，取下層溶液40℃氮?dú)鈸]干。殘?jiān)昧鲃?dòng)相復(fù)溶至50 μl，10 000 r·min－1離心 5 min，取上清，進(jìn)樣 20 μl于高效液相色譜儀測(cè)定。

2.2.2 透析外液 取透析外液300 μl于1.5 ml的離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液 10 μl，其余操作同“2.2.1”項(xiàng)下血漿樣品的處理。

2.3 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定［3－4］將長(zhǎng)約10 cm的透析袋一端結(jié)扎，加入2 ml空白血漿，將其另一端扎緊后，懸浮于盛有20 ml含藥緩沖溶液［5］的廣口瓶中，并將其放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中使其平衡。透析結(jié)束后，分別測(cè)定透析袋內(nèi)血漿藥物濃度和透析外液中藥物濃度，計(jì)算藥物的血漿蛋白結(jié)合率，并用10%(V/V)高氯酸溶液檢查透析外液有無蛋白漏出，棄掉漏出者。

Fig 1 HPLC chromatograms of P-8

3 結(jié)果

3.1 專屬性 在本實(shí)驗(yàn)條件下，甲苯磺烷唑胺出峰時(shí)間為15 min左右，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間為5.5 min左右，空白透析液和空白血漿中均無雜峰干擾，甲苯磺烷唑胺和內(nèi)標(biāo)都能達(dá)到良好分離(Fig 1)。

3.2 線性關(guān)系

3.3.1 透析內(nèi)液 精密稱取甲苯磺烷唑胺10.0 mg于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并用甲醇稀釋成濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取空白大鼠或人血漿150 μl，分別加入5 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)樣檢測(cè)。以甲苯磺烷唑胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程見Tab 1。

3.2.2 透析外液 取空白透析液300 μl，分別加入10 μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，其余同透析內(nèi)液?；貧w方程見Tab 1。

Tab 1 Standard curves of P-8

3.3 精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率 按“3.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)濃度的模擬血漿樣品和模擬透析液樣品，按各樣品處理方法考察精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率，結(jié)果見Tab 2。

Tab 2 Accuracy，precision and recovery of P-8

3.4 穩(wěn)定性 分別考察“3.3”項(xiàng)下模擬生物樣品于－20℃凍藏1周，反復(fù)凍融2次，殘?jiān)?℃放置2 d和預(yù)處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性。此外，考察了含藥透析液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果，各個(gè)濃度樣品在上述條件下比較穩(wěn)定。

3.5 透析膜的吸附考察［5］將含有2 ml空白透析液的透析袋懸浮于盛有20 ml含藥透析液的廣口瓶中，37℃放置24 h后測(cè)定袋外的藥物濃度，考察透析膜對(duì)藥物的吸附。結(jié)果，低、中、高3個(gè)濃度下吸附率分別為1.70%、7.01%和8.82%，表明透析膜對(duì)藥物有微量吸附，但其對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響可以忽略。

Tab 3 Plasma protein binding rates of P-8

3.6 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定 按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察3個(gè)濃度下甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結(jié)合率，每個(gè)濃度3個(gè)樣本，分別于不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，考察透析平衡時(shí)間。結(jié)果見Tab 3，甲苯磺烷唑胺在24 h時(shí)在大鼠或人血漿中透析已達(dá)到平衡，大鼠和人的平均血漿蛋白結(jié)合率分別為(96.03±0.10)%和(94.24±0.52)%。

通過SPSS 13.0軟件對(duì)24 h的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，比較各濃度組間血漿蛋白結(jié)合率的差異以及甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率的差異。結(jié)果表明，各濃度組間大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率差異均無顯著性(P＞0.05)，即甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結(jié)合率無濃度依賴性;甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率有種屬差異性(P＜0.05)，大鼠血漿蛋白結(jié)合率高于人血漿蛋白結(jié)合率。

4 討論

血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定是新藥臨床前研究的重要內(nèi)容之一，藥物在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，血漿中只有游離型藥物才能產(chǎn)生藥效。此外，游離型藥物的濃度與藥物的毒理學(xué)過程也密切相關(guān)。因此，藥物的蛋白結(jié)合率研究具有重要意義。

首先建立了甲苯磺烷唑胺血漿樣品的HPLC分析方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、選擇性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度均符合生物樣品分析方法的要求。平衡透析法是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法，與其他方法相比，具有原理簡(jiǎn)單，操作方便，成本較低的優(yōu)點(diǎn)。我們采用平衡透析法對(duì)甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明甲苯磺烷唑胺與大鼠和人的血漿蛋白都有較強(qiáng)的結(jié)合(血漿蛋白結(jié)合率＞90%)，無濃度依賴性，說明在0.1～0.5 mg·L－1范圍內(nèi)，甲苯磺烷唑胺與血漿蛋白的結(jié)合未達(dá)到飽和;甲苯磺烷唑胺與大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率有種屬差異性，大鼠血漿蛋白結(jié)合率高于人血漿蛋白結(jié)合率。

綜上，本研究首次建立了甲苯磺烷唑胺生物樣品的測(cè)定方法，并對(duì)甲苯磺烷唑胺大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行了比較研究，這將為下一步臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。甲苯磺烷唑胺的血漿蛋白結(jié)合率很高，提示當(dāng)其與其它高蛋白結(jié)合率的藥物同時(shí)應(yīng)用于臨床時(shí)，我們應(yīng)該注意它們與血漿蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用。

［1］ 汪 海.職業(yè)性高原病藥物治療學(xué)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2010:303 －6.

［1］ Wang H.Drug therapeutics of occupational plateau disease［M］.Beijing:Military Medical Science Press，2010:303 －6.

［2］ 舒玉剛，張東祥，肖忠海，等.碳酸酐酶靶向性抑制劑甲苯磺烷唑胺對(duì)機(jī)體缺氧耐力的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011，27(3):276－9.

［2］ Shu Y G，Zhang D X，Xiao Z H，et al.Effect of neotype carbonic anhydrase target-based inhibitors(P-8)on the hypoxic tolerance in mice［J］.Chin J Appl Physiol，2011，27(3):276 －9.

［3］ 馮志強(qiáng)，韓 堅(jiān)，謝智勇，等.黃芩提取物中黃酮類成分血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(2):286 －9.

［3］ Feng Z Q，Han J，Xie Z Y，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in scutellaria baicalensis Georgi［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):286 －9.

［4］ 周 玲，居文政，劉子修，等.燈盞細(xì)辛注射液多成分血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):719－22.

［4］ Zhou L，Ju W Z，Liu Z X，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in Dengzhanxixin injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):719 －22.

［5］ 劉 曉，陳曉輝，劉文濤，等.阿比朵兒人血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2007，26(2):115 －9.

［5］ Liu X，Chen X H，Liu W T，et al.Determination of plasma protein binding rate of arbidol［J］.Chin J New Drugs Clin Rem，2007，26(2):115－9.