革皮氏海參總皂苷對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

賀 敏，王靜鳳，柳 東，李 冰，王玉明，薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003)

海參營養(yǎng)和功效成分豐富，對(duì)人體具有很好的保健功能。海參體壁中富含海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白、海參腦苷脂等多種活性物質(zhì)，具有較高的食用和藥用價(jià)值［1－2］。海參皂苷是海參的主要次生代謝產(chǎn)物，一般為羊毛甾烷型三萜皂苷，具有抗腫瘤、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒作用和溶血作用等多種生理活性［3－4］。海參皂苷的結(jié)構(gòu)因其種類和生長環(huán)境的不同而不同。革皮氏海參體壁中富含海參皂苷(含量為3.514%)，可作為海參皂苷的良好來源。王靜鳳等［5］研究發(fā)現(xiàn)，革皮氏海參總皂苷對(duì)小鼠具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。劉治東［6］研究發(fā)現(xiàn)，革皮氏海參總皂苷能明顯抑制小鼠移植瘤的生長，并能明顯提高小鼠體內(nèi)抗氧化和代謝致癌物質(zhì)的能力。李冰等［2］從造血干細(xì)胞增殖和分化方面進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)革皮氏海參皂苷對(duì)骨髓損傷模型小鼠有促進(jìn)造血的作用，但其作未用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究了革皮氏海參皂苷對(duì)骨髓細(xì)胞周期和凋亡的影響，進(jìn)一步探討海參皂苷促進(jìn)骨髓抑制模型小鼠造血功能恢復(fù)的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 海參 革皮氏海參(Pearsonothuria graeffei)，購于青島南山市場，中國科學(xué)院海洋研究所研究員廖玉麟對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂ ICR小鼠，18～20 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為 SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)溫度22～24℃，相對(duì)濕度52% ～58%，12:12 h明暗交替。

1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)，為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品;碘化丙碇(propidium iodide，PI)、羧甲基纖維素，由Sigma公司提供;TRIzol Reagent，Invitrgen 產(chǎn) 品;TaqDNA 聚合酶、dNTPs、RNase Free水、DNA Marker DL2000，為 TaKaRa產(chǎn)品;M-MLV Reverse Transcriptase，為 Promega產(chǎn)品;AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，為瑞士羅氏公司產(chǎn)品;CyclinB1、bcl-2、bcl-xl及 β-actin上下游引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 主要使用儀器 BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司;Mini-Protean電泳儀，日本 BIORAD公司;FACS.VAN.TAGE流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品;GL-20M型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司;TC-96 Life Pro基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司;DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠;JS-780型全自動(dòng)凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 革皮氏海參皂苷的制備 革皮氏海參干品粉碎成粉，按1∶10(m/V)的料液比用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液提取。合并提取液，減壓濃縮，得到的流浸膏分散于水中，過HP-20型大孔樹脂柱，以80%乙醇洗脫，收集洗脫組分，減壓濃縮、真空冷凍干燥，得到革皮氏海參總皂苷。采用香草醛－冰乙酸比色法測定所得海參皂苷的純度為65.04%。臨用時(shí)用0.5%羧甲基纖維素配制。

2.2 動(dòng)物分組及模型建立 ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為4組，每組10只。給藥組分別灌胃不同濃度的海參總皂苷溶液［分別為10和30 mg(kg·bw)－1］，正常對(duì)照組灌胃0.5%羧甲基纖維素，灌胃體積為0.01 ml(g·bw)－1，1 天 1 次，連續(xù) 16 d。除正常對(duì)照組外，其余3組均于首次給藥后第7 d，腹腔注射 Cy 100 mg·kg－1，1 天 1 次，連續(xù) 3 d，造模。于末次給藥2 h后，脫頸椎處死，無菌剝離股骨，備用。

2.3 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù) 參見文獻(xiàn)［7］方法，用5 ml 3%的醋酸溶液沖出髓腔內(nèi)全部細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出每根骨髓含有的有核細(xì)胞數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓細(xì)胞周期分布 用5 ml生理鹽水沖出髓腔內(nèi)全部細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，收集1×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)PBS洗2次，用預(yù)冷的75%乙醇固定24 h。固定的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次，加入PI染液 (50 mg/L－1PI、0.1 g/L－1RNase A、0.1%Triton-X 100)，置4℃避光染色30 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。每個(gè)樣本均獲取10 000個(gè)細(xì)胞，采用WinMDI 2.9軟件系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓細(xì)胞凋亡率 取1×106個(gè)骨髓細(xì)胞，參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒方法處理后，采用流式細(xì)胞儀檢測。以未染色細(xì)胞調(diào)零，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管做為基準(zhǔn)參照，測定每個(gè)上樣管數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本均獲取10 000個(gè)細(xì)胞，用WinMD 2.8軟件進(jìn)行分析。

2.6 對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因cyclin B1和抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達(dá)的影響 采用TRIzol法提取骨髓細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所得cDNA為模板進(jìn)行RTPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括 cDNA 3 μl，MgCl2(25 mM)1.8 μl，10 × PCR buffers 3 μl，dNTP(10 mmol·L－1)1.2 μl，TaqDNA 聚合酶(5 U/μl)1 μl，10 μmol·L－1引物各 0.6 μl，以 RNase Free 水補(bǔ)足體積至30 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s;退火30 s;72℃延伸45 s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。引物設(shè)計(jì)見Tab 1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用 Image J(version 1.41o)圖像分析軟件分析各目的基因條帶的灰度值，以β-actin作內(nèi)參校正，用目的基因灰度值與βactin灰度值的比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences，length of products，annealing temperature and cycles of different genes

3 結(jié)果

3.1 對(duì)骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響 骨髓有核細(xì)胞數(shù)代表骨髓的造血能力。結(jié)果如Fig 1所示，模型對(duì)照組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低，與正常對(duì)照組比較，降低了30.89%(P＜0.05)。灌胃低高劑量革皮氏海參總皂苷后，骨髓有核細(xì)胞數(shù)增加，與模型對(duì)照組比較，分別增加了42.32%和32.25%(P＜0.01，P＜0.05)。表明革皮氏海參總皂苷可有效減輕Cy對(duì)模型小鼠骨髓細(xì)胞抑制的作用，恢復(fù)骨髓造血功能。

Fig 1 Effect of saponins of P.graeffei on the number of BMC in mice

3.2 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響 結(jié)果如Tab 2所示，與正常對(duì)照組比較，模型小鼠骨髓細(xì)胞周期S期百分率上升，G2/M期百分率下降，說明環(huán)磷酰胺使骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯。經(jīng)革皮氏海參總皂苷作用后，模型小鼠骨髓細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，低、高劑量組小鼠S期骨髓細(xì)胞數(shù)較模型組分別降低了37.90%和25.86%，G2/M期分別提高了408.5%和221.6%。表明革皮氏海參總皂苷使骨髓細(xì)胞周期由S期向G2/M期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖。

Tab 2 Effects of saponins of P.graeffei on the cell cycle of BMC

3.3 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如Fig 2所示，與正常對(duì)照組比較，模型小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率明顯上升，為22.8%(P＜0.01)，說明環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞凋亡。與模型對(duì)照組比較，低高劑量組小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率明顯降低，分別為15.0%和11.2%(P＜0.01，P＜0.01)。表明，革皮氏海參總皂苷可明顯降低骨髓損傷小鼠骨髓細(xì)胞的凋亡率，且劑量效應(yīng)關(guān)系明顯。

3.4 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期基因cyclin B1mRNA表達(dá)的影響 Cyclin B1是控制細(xì)胞進(jìn)入G2/M期的關(guān)鍵因子。革皮氏海參總皂苷能上調(diào)模型小鼠骨髓細(xì)胞cyclin B1 mRNA的表達(dá)，且劑量效應(yīng)關(guān)系明顯(見Fig 3)。與模型對(duì)照組比較，低、高劑量組小鼠cyclin B1 mRNA表達(dá)量分別升高了20.19%和82.35%(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3.5 對(duì)抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達(dá)的影響 Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)，bcl-2對(duì)抗各種凋亡的刺激而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，bcl-xl通過阻止細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡。結(jié)果如Fig 3所示，與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制小鼠的抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表達(dá)量減低(P＜0.01，P＜0.01)，表明環(huán)磷酰胺可引起小鼠骨髓細(xì)胞凋亡。與模型對(duì)照組比較，皂苷低高劑量組小鼠的bcl-2和bcl-xl mRNA的表達(dá)增加，且劑量效應(yīng)關(guān)系明顯。其中，低高劑量組bcl-2 mRNA的表達(dá)量分別提高了31.2%(P＜0.05)和58.1%(P＜0.01)，bcl-xl mRNA表達(dá)上調(diào)了24.4%(P＜0.01)和37.8%(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of saponins of P.graeffei on the apoptosis of BMC cells in mice

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)等手段研究了革皮氏海參總皂苷對(duì)環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制模型小鼠骨髓細(xì)胞生長的影響及其分子機(jī)制。結(jié)果表明，革皮氏海參總皂苷可增加骨髓有核細(xì)胞的數(shù)量，改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的S期阻滯，促進(jìn)骨髓抑制模型小鼠骨髓細(xì)胞周期由S期向G2/M轉(zhuǎn)變，并進(jìn)一步證明促進(jìn)模型小鼠骨髓細(xì)胞周期基因Cyclin B1 mRNA的表達(dá);而且革皮氏海參總皂苷可顯著降低模型小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率，提高模型小鼠抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA表達(dá)，提示革皮氏海參總皂苷可通過抑制骨髓細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖而達(dá)到促進(jìn)造血的目的。

骨髓細(xì)胞周期是反映造血系統(tǒng)造血功能的重要指標(biāo)之一，細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的分布情況可以反映骨髓細(xì)胞增殖的狀態(tài)。細(xì)胞周期的主要調(diào)節(jié)成分是細(xì)胞周期蛋白(cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (cyclin dependent protein kinases，CDKs)。細(xì)胞周期蛋白 cyclin B1［8－11］與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDKs結(jié)合，受磷酸化、去磷酸化調(diào)節(jié)，所形成的活性復(fù)合物能轉(zhuǎn)位入核，磷酸化其核內(nèi)底物，促進(jìn)細(xì)胞的G2/M期轉(zhuǎn)變。王勇等［12］報(bào)道，人參總皂苷可促進(jìn)骨髓細(xì)胞由相對(duì)靜止期G0/G1期進(jìn)入增殖活躍期G2/M期。另有研究表明，紅景天苷促使骨髓抑制貧血小鼠骨髓細(xì)胞從S期向G2/M期轉(zhuǎn)化。提示皂苷類物質(zhì)可抑制由環(huán)磷酰胺引起的S期阻滯。

Fig 3 Effect of saponins of P.graeffei on mRNA expression of cyclinB1，bcl-xl and bcl-2 in BMC

Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要基因蛋白，分為抗凋亡(bcl-2、bcl-xl等)和促凋亡(bax、bad 等)兩大亞家族［13］。bcl-2［14］能抑制極廣泛的凋亡因素引發(fā)的凋亡，延長細(xì)胞壽命。bcl-xl［15－16］參與負(fù)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，通過與Bcl-2家族促凋亡蛋白形成異源二聚體，影響后者的促凋亡作用，從而最終阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。研究證實(shí)［17］，抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl表達(dá)增強(qiáng)，可抑制由環(huán)磷酰胺造成的骨髓細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞增殖和修復(fù)的目的。

綜上所述，革皮氏海參總皂苷促進(jìn)骨髓抑制小鼠造血功能的恢復(fù)。其作用途徑可能通過調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞周期分布，提高細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的表達(dá)水平，刺激造血細(xì)胞增殖，并通過提高抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表達(dá)，抑制造血細(xì)胞凋亡。

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