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    UPLC-MS/MS測(cè)定黑小麥中B族維生素

    2012-07-21 07:45:16李新生楊智勇馬嬌燕
    中國(guó)生化藥物雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜

    韓 豪,李新生,2,3,高 玥,劉 新,楊智勇,馬嬌燕

    (1.陜西理工學(xué)院,2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心,陜西 漢中723000)

    B族維生素是一類水溶性物質(zhì),主要包括硫胺素(維生素 B1,VB1),核黃素(維生素 B2,VB2)和吡哆素(維生素B6,VB6)等。VB1具有醛基轉(zhuǎn)移和α-酮酸的脫羧作用,缺少它會(huì)得腳氣病、神經(jīng)性皮炎等。VB2在生物體內(nèi)起傳遞氫的作用,缺少時(shí)易患口腔炎、皮炎、微血管增生等。VB6是氨基酸轉(zhuǎn)氨基、脫羧作用,是合成神經(jīng)遞質(zhì)的必需品[1-2]。

    目前B族維生素的檢測(cè)方法很多,我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法中對(duì)VB1采用熒光法,藥典中對(duì)VB1、VB6采用分光光度法[3],國(guó)際上通用的關(guān)于 B族維生素的檢測(cè)方法大多為20多年前建立的微生物法[4]。這些方法僅能測(cè)定其中的單一組分,且步驟煩瑣,對(duì)于某些食物樣品,還要用專門的萃取方法除去干擾物后才能測(cè)定。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多種B族維生素的同時(shí)測(cè)定進(jìn)行了大量研究,建立了許多分析方法,如高效毛細(xì)管電泳法[5-6]和高效液相色譜法[7-12]。本研究建立了超高效液相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法,高效快速檢測(cè) VB1、VB2和VB6的含量。

    1 材料

    5個(gè)黑小麥樣品 YK-1、YK-2、YK-3、YK-5 和YK-6,由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。

    VB1(含量98%)、VB2(含量98%)和VB6(含量100%)對(duì)照品,購(gòu)于天津一方科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

    UPLC-MS/MS聯(lián)用儀,配電噴霧離子源(ESI),美國(guó)Waters公司;LC-800離心機(jī),科大創(chuàng)新股份有限公司;SK-120E超聲波清洗機(jī),寧波科生儀器廠。

    2 方法

    2.1 色譜條件

    色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×50 mm,1.7 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相:A相為乙腈,B相為0.1%甲酸溶液,采用梯度洗脫:A 相 0~4.0 min由 95%變?yōu)?20%、4.0~7.0 min由20%變?yōu)?0%、7.0~8.0 min由80%變?yōu)?5%;流速:0.3 mL/min;分析運(yùn)行時(shí)間8 min。

    2.2 質(zhì)譜條件

    離子源:ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);毛細(xì)管電壓:3 kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:650 L/h;錐孔氣流量:50 L/h。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    分別稱取 VB1、VB2和 VB6對(duì)照品 1.95,1.01和2.07 mg,置25 mL量瓶中,用1%甲酸溶液溶解并稀釋至刻度,得濃度分別為78,40.28 和82.8 μg/mL的VB1、VB2和VB6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

    取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,逐級(jí)稀釋得濃度分別為31.2,62.4,93.6,124.8 和 156 ng/mL 的 VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為 32.22,64.44,96.66,128.88 和161.10 ng/mL 的 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為 16.56,33.12,49.68,66.24 和82.80 ng/mL 的 VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2.4 定量限實(shí)驗(yàn)

    分別取VB1、VB2和VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,在相同的液相質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析,以S/N=10,確定VB1、VB2和VB6的定量限。

    2.5 樣品溶液制備

    稱取黑小麥全粉20 g,用濾紙包好,加入石油醚150 mL,在60℃下索氏提取2 h。將脫脂后的黑小麥全粉置于50 mL棕色量瓶中,加入1%甲酸溶液50 mL,室溫下用超聲波提取20 min,冷卻后,4 000 r/min離心15 min,倒出上清液,將沉淀轉(zhuǎn)入量瓶中。重復(fù)以上步驟,再超聲提取兩次,合并三次提取液。加入淀粉酶1 mL,酶解1 h,再加入糖化酶1 mg,酶解 1 h。加 1% 甲酸溶液至 250 mL。0.2 μm過濾器過濾后,注入U(xiǎn)PLC-MS/MS儀檢測(cè)。

    3 結(jié)果

    3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    首先將濃度在500~1 000 ng/mL的3個(gè)維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,確定了VB1、VB2和VB6的分子離子[M+H]+ 為 m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04。然后以m/z 265.93、m/z 377.06 和 m/z 170.04 為母離子,對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描,在2.2項(xiàng)質(zhì)譜條件下,VB1主要有 m/z 143.97、m/z 122兩個(gè)子離子,其質(zhì)譜圖如圖1所示;VB2主要有m/z 243、m/z 172兩個(gè)子離子,其質(zhì)譜圖如圖2所示;VB6主要有m/z 134、m/z 76.96兩個(gè)子離子,其質(zhì)譜圖如圖3所示。本方法選擇豐度較高,干擾較小的離子對(duì)(m/z 265.93 > 143.97,265.93 > 122;377.06 > 243,377.06 >172;170.04 >134,170.04 >76.96)作為定性離子對(duì),選擇豐度最高的離子對(duì)(m/z 264.93>122,377.06 > 172,170.04 > 76.96)作為定量離子對(duì),在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)優(yōu)化了碰撞電壓和錐孔電壓。得到最佳錐孔電壓和碰撞電壓,如表1所示。

    圖1 VB1質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of VB1

    圖2 VB2質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of VB2

    圖3 VB6質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of VB6

    表1 最佳錐孔電壓和碰撞電壓Tab.1 The best cone voltages and collision voltages

    3.2 線性范圍和定量限

    以濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,VB1、VB2和VB6的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為 Y=62.94 X -349.38(r=0.999 8),Y=120.62 X+2 323.27(r=0.999 9),Y=271.16 X+4 406.22(r=0.999 9),在20 ~200 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,以 S/N=10,得 VB1、VB2和 VB6的定量限分別為 0.62,0.32 和 0.50 ng/mL。

    3.3 精密度試驗(yàn)

    取同一對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10 μL,測(cè)定 VB1、VB2和 VB6的峰面積,結(jié)果 VB1、VB2和VB6峰面積的 RSD(n=6)分別為0.21%,0.11%和 0.15%。

    3.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

    精密稱取6份YK-1黑小麥樣品,按照2.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液,以上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算黑小麥(YK-1)VB1、VB2和VB6含量的RSD(n=6)分別為 0.87%,0.69% 和 0.77%,表明該方法的重復(fù)性良好。

    取同一供試品溶液,在室溫下,分別于制備后0,3,6,9 和12 h 進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果 VB1、VB2和 VB6的RSD(n=6)分別為 1.51%,1.09% 和 1.24%,表明VB1、VB2和 VB6在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    3.5 回收率試驗(yàn)

    準(zhǔn)確稱取已知 VB1(1.792 μg/g)、VB2(0.875 μg/g)和 VB6(0.554 μg/g)含量的同一批次 YK-1黑小麥全麥粉20 g,5份,分別加入VB1(62.4 ng/mL),VB2(32.22 ng/mL),VB6(16.56 ng/mL)對(duì)照品溶液1 mL。按照2.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液,進(jìn)樣測(cè)定。VB1的平均回收率為97.50%,RSD為3.09%;VB2的平均回收率為 97.91%,RSD 為3.90%;VB6的平均回收率為 99.32%,RSD 為2.84%。見表 2。

    表2 VB1、VB2和VB6的回收率Tab.2 Recovery of VB1,VB2and VB6

    3.6 樣品含量測(cè)定

    分別精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL,注入U(xiǎn)PLC-MS/MS儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中VB1、VB2和VB6的含量。色譜圖見圖4~6。從表3可見,黑小麥VB1的含量為0.965 ~1.961 μg/g,黑小麥 VB2的含量為 0.614~0.963 μg/g,黑小麥 VB6的含量為 0.364 ~0.625 μg/g。不同品種黑小麥VB1、VB2和VB6的含量存在較大差異。

    圖4 VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.4 Total ion current of VB1solution and black wheat(YK-1)

    4 討論

    小麥中B族維生素主要存在于小麥的胚芽和種皮中,小麥的胚芽和種皮中均含有脂溶性成分,而維生素為水溶性化合物,因此,黑小麥全麥粉經(jīng)脫脂后有助于維生素的提取。黑小麥全麥粉中淀粉含量較高,因此提取溫度不宜過高,否則淀粉糊化后會(huì)降低維生素的溶出率。

    圖5 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.5 Total ion current of VB2solution and black wheat(YK-1)

    圖6 VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和黑小麥YK-1(B)總離子色譜圖Fig.6 Total ion current of VB6solution and black wheat(YK-1)

    表3 黑小麥中VB1、VB2和VB6的含量Table.3 The content of VB1,VB2and VB6in black wheat samples

    本文對(duì)溶解維生素的溶劑進(jìn)行篩選,采用50%甲醇、水、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)、1%甲酸溶液配制VB1、VB2、VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液,在確定的液相和質(zhì)譜條件下,采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè),結(jié)果表明50%甲醇、甲醇(1%甲酸)、50%甲醇(1%甲酸)均出現(xiàn)峰拖尾的現(xiàn)象,水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值較低,而以1%甲酸溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液,響應(yīng)值最高。

    在本研究中,樣品前處理過程簡(jiǎn)單、時(shí)間短,VB1、VB2和VB6在20~200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;加樣回收率分別為97.50%,97.91%和99.32%。黑小麥中 VB1、VB2和 VB6的含量分別為0.965~1.961,0.614 ~0.963 和 0.364 ~0.625 μg/g。本研究為谷類作物以及食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)中VB1、VB2和VB6含量的檢測(cè)提供一種快速、高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)手段。

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