細(xì) 胞 衰 老 與 腎 移 植

謝軻楠 綜述 孫啟全 審校

細(xì)胞衰老是生物界的普遍現(xiàn)象，對多細(xì)胞有機(jī)體來說，由受精卵分裂、分化出執(zhí)行不同功能的細(xì)胞，這些細(xì)胞從產(chǎn)生開始，就處在衰老的過程中，直到凋亡。細(xì)胞衰老是一個復(fù)雜的生理過程，最初在腫瘤和慢性疾病領(lǐng)域被關(guān)注。在腎移植，人們對細(xì)胞衰老現(xiàn)象的研究源于移植腎慢性化病變(腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化)的研究。隨著認(rèn)識逐漸加深，目前發(fā)現(xiàn)移植腎排斥反應(yīng)、慢性移植腎功能不全都與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。細(xì)胞衰老的指標(biāo)甚至可能用以推斷移植器官的預(yù)后。本文就細(xì)胞衰老在腎移植方面的研究進(jìn)展作一簡述。

相關(guān)定義

我們通常所說的“年齡”指的是生物體從出生算起所經(jīng)歷的時間。而細(xì)胞衰老又稱復(fù)制衰老，或復(fù)制停止，是最初在體外實(shí)驗(yàn)中提出來的細(xì)胞水平的概念，指細(xì)胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下不可逆地脫離細(xì)胞周期并喪失增生能力后進(jìn)入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。細(xì)胞衰老是生物體中普遍存在的一種不可逆的生長停滯的現(xiàn)象，是器官衰老的基礎(chǔ)，細(xì)胞衰老可能對器官造成以下影響：器官中衰老的細(xì)胞數(shù)比例較高，可能影響其行使正常的功能和維持器官的完整性，降低器官對抗壓力和適應(yīng)環(huán)境改變的能力，表現(xiàn)出器官功能不全；細(xì)胞衰老影響器官損傷的正常修復(fù)過程，導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)的炎癥狀態(tài)持續(xù)，推進(jìn)纖維化的進(jìn)展。所以，目前普遍認(rèn)為細(xì)胞衰老與生理及病理情況下器官功能變化密切相關(guān)。

細(xì)胞衰老的信號途徑

細(xì)胞衰老的過程可能由多種刺激或應(yīng)激原觸發(fā)。對于細(xì)胞衰老的認(rèn)識，源于20世紀(jì)60年代Hayflick和Moorhead對體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀察(即著名的端粒學(xué)說)，1961年Leonard Hayflick發(fā)現(xiàn)，端粒的長度隨著細(xì)胞復(fù)制周期的增加而逐漸縮短(被形象地稱為“端粒損耗”)，當(dāng)端?？s短至一定長度，即在有限的復(fù)制周期之后，細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制停滯或死亡。由此可見，細(xì)胞衰老與端?？s短、端粒功能障礙、DNA損傷(如由于X線、氧化應(yīng)激、紫外線輻射等造成)、致癌基因等產(chǎn)生的異常絲裂信號及非遺傳毒性應(yīng)激(如表觀遺傳變異)等多種應(yīng)激原相關(guān)[1,2]。

盡管觸發(fā)細(xì)胞衰老的應(yīng)激原可能多種多樣，但細(xì)胞衰老的主要信號途徑只有兩條(圖1)：ARF-p53-p21信號通路(與端粒相關(guān))和p16-pRb信號通路(與端粒無關(guān))。這兩條通路彼此關(guān)聯(lián)、相互影響，但分別都能獨(dú)立引發(fā)衰老過程[1,4]。由體外實(shí)驗(yàn)提出的端粒學(xué)說發(fā)展至今，細(xì)胞衰老的現(xiàn)象終于在近年廣泛開展的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)它的存在與重要作用。

圖1 細(xì)胞衰老的兩條信號途徑[3]

端?？s短和p53途徑端粒是位于染色體末端的DNA-蛋白復(fù)合物，其DNA序列由生物特異性的簡單串聯(lián)重復(fù)序列組成(在人類，由TTAGGG串聯(lián)重復(fù)序列組成)，端粒具有維持染色體結(jié)構(gòu)完整和保證染色體末端被正確復(fù)制的作用。端粒使正常染色體端部間不發(fā)生融合，并可補(bǔ)償滯后鏈5’末端在消除RNA引物后造成的空缺，維持染色體完整、穩(wěn)定并行使其正常功能。端粒DNA由端粒酶合成，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，以自身RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，通過在染色體末端直接添加端粒的DNA重復(fù)序列從而阻止端?？s短。由于人類大多數(shù)體細(xì)胞并不表達(dá)端粒酶，因此端粒隨著細(xì)胞不斷分裂而逐漸縮短[1]。當(dāng)端?？s短至一定長度(達(dá)“Hayflick 極限”)，將觸發(fā)由多種蛋白激酶(如ATM和CHK2)、銜接蛋白(如53BP1和MDC1)和染色質(zhì)修飾因子(如γH2AX)參與經(jīng)典的DNA損傷反應(yīng)，使細(xì)胞停止分裂，導(dǎo)致細(xì)胞衰老與死亡。

端粒縮短通過p53磷酸化作用激活細(xì)胞衰老的p53途徑，并伴有p21(也稱CDKN1A、p21Cip1，Waf1或SDI1)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停止。p53、p21基因分別定位于17p13.1和6p21.2，編碼抑癌蛋白p53和細(xì)胞周期蛋白抑制因子p21。p53 是一種應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞受到刺激后迅速上調(diào)，激活p21 基因，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期蛋白A(cyclin A)的活性，阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB蛋白)的磷酸化和細(xì)胞周期的進(jìn)行。除端?？s短外，p53途徑也可能參與或引發(fā)由DNA損傷引起的衰老現(xiàn)象。生理情況下端?？s短是伴隨體細(xì)胞分裂而出現(xiàn)的不可避免的現(xiàn)象，然而環(huán)境因素或類似于端粒酶變異等基因突變也參與影響端粒長度[5]。

目前實(shí)體器官移植是否加速端粒縮短的問題尚存爭議。觀察腎小管上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，移植可能加速細(xì)胞周期[6]。在腎移植初期，對于增生細(xì)胞核抗原(PCNA)的觀察發(fā)現(xiàn)，移植后迅速出現(xiàn)上皮細(xì)胞再生增加，并且與缺血時間相關(guān)。隨著再灌注時間的推遲(即缺血時間的延長)，PCNA的表達(dá)增加[7]。一般情況下，即使是生長因子刺激，腎小管細(xì)胞也不易增生。然而缺血時，殘存的腎小管細(xì)胞能夠重新進(jìn)入細(xì)胞周期，開始復(fù)制，從而替代損傷的細(xì)胞[8]。盡管尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)，但可以推斷，這些上皮細(xì)胞復(fù)制周期的增加，很可能增加端粒損耗。移植手術(shù)相關(guān)的缺血再灌注損傷引起細(xì)胞復(fù)制周期的增加和端粒的損耗的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步的研究。

Koppelstaetter等[9]觀察到，移植術(shù)前患者腎組織標(biāo)本中的端粒長度，與術(shù)后第12個月移植腎功能惡化(以血清肌酐水平反映)獨(dú)立相關(guān)。在這項研究中，腎移植術(shù)前p21的表達(dá)水平與供者年齡及術(shù)后移植腎功能惡化均無明確相關(guān)性。在另一項研究中，Melk等[10]發(fā)現(xiàn)，供者年齡(即在紀(jì)年意義上腎臟的年齡)和p21及p53表達(dá)水平均無明確相關(guān)性，相似地，ARF蛋白與腎臟的年齡也無顯示出明確相關(guān)性。然而，p53的表達(dá)和組織學(xué)上觀察到的腎小管萎縮、腎小球硬化卻有顯著關(guān)系，這種關(guān)系的產(chǎn)生機(jī)制，可能與腎臟的年齡以及與腎小管萎縮相關(guān)的ARF蛋白的表達(dá)無關(guān)。具體機(jī)制目前尚未闡明，但可以假設(shè)，p53信號通路并不是造成老年腎臟(即來源于高齡供者的腎臟)組織上慢性化病變的主要原因，可能其他的信號通路(如p16信號通路)起到更為關(guān)鍵的作用。關(guān)于老年腎臟端粒縮短和p53信號通路介導(dǎo)的衰老現(xiàn)象和纖維化過程，尚需進(jìn)一步研究。

關(guān)于環(huán)孢素的研究有一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，環(huán)孢素可能由于產(chǎn)生活性氧簇從而誘發(fā)端?？s短、激活p53通路、增加腎小管上皮細(xì)胞p21的表達(dá)[11,12]。使用環(huán)孢素治療后，細(xì)胞停止在G0/G1期，可見在存活細(xì)胞總數(shù)不變的情況下，存在環(huán)孢素劑量依賴性的DNA合成減少。環(huán)孢素并不能誘導(dǎo)凋亡，這提示端?？s短介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯，僅能造成衰老現(xiàn)象，而不能啟動程序性的細(xì)胞死亡[12]。環(huán)孢素不僅激活p53-p21信號通路，還同時增加p16的表達(dá)，這是否在環(huán)孢素腎毒性的發(fā)生和進(jìn)展中起到作用尚不清楚[13]。

Chkhotua等對14例正常人及9例移植腎慢性排斥反應(yīng)的腎組織標(biāo)本的研究表明，移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的次數(shù)與端粒長度縮短相關(guān)[14]。然而，考慮到選擇偏倚可能影響觀察結(jié)果，且該研究病例數(shù)太少而不能得到有足夠說服力的結(jié)論。在之前的一項動物研究中發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后60d，同基因移植物和異基因移植物端?？s短程度相似，并且相對于供受者的遺傳背景差異，端粒縮短與缺血-再灌注的時間反而關(guān)系更為顯著，而非排斥反應(yīng)[15]。在這項研究中，僅在發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的動物模型中可見β半乳糖苷酶(SA-βgal，細(xì)胞衰老的一個生物學(xué)標(biāo)志物)表達(dá)增加。

p16-pRB途徑p16蛋白與細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D)競爭性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase 4/6，CDK4/CDK6)，抑制CDK4/CDK6的催化活性，從而抑制RB蛋白磷酸化，減少延伸因子E2F釋放，使細(xì)胞分裂不能通過G1-S期限制點(diǎn)而被阻滯于G1期[1]。

引發(fā)DNA損傷反應(yīng)的信號同時激活p16-pRB通路，尤其是在上皮細(xì)胞，盡管端粒功能障礙也能誘發(fā)p16表達(dá)，但p16的表達(dá)反映最初的環(huán)境應(yīng)激[1]，這種非端粒依賴的細(xì)胞衰老途徑近期被命名為“STASIS(stress and aberrant signaling-induced senescence)”。

p16蛋白由CDKN2A編碼。CDKN2A也編碼ARF蛋白，而ARF蛋白是p53信號通路的重要的組成部分[1]。由此可見，p53信號通路和p16-pRB信號通路相互影響，且兩者存在反作用。盡管如此，兩條信號通路均可獨(dú)立抑制細(xì)胞周期。由于大多數(shù)衰老的細(xì)胞都表達(dá)p16，p16目前被認(rèn)為可用于識別衰老的細(xì)胞。

與p16信號通路激活相關(guān)的細(xì)胞衰老現(xiàn)象在腎移植術(shù)后起到重要作用。在小鼠中觀察到，p16的表達(dá)隨著年齡的增長而增加(但不伴端?？s短，因?yàn)樾∈蟛淮嬖诙肆？s短的現(xiàn)象)，移植年老的腎臟，可見p16表達(dá)迅速增加，并且更明顯地表現(xiàn)出術(shù)后組織學(xué)上的慢性化改變(包括腎小管基膜皺縮)。與之不同的是，年輕的動物移植年老的腎臟之后僅有輕度的p16表達(dá)增加[16]，這說明，在高齡的動物，既存在較高的p16基礎(chǔ)水平，并且p16的水平在移植后相對快速地增加。同時發(fā)現(xiàn)，高齡的動物腎移植后Ki-67的表達(dá)明顯減少，Ki-67被認(rèn)為是一個反映增生和上皮細(xì)胞再生能力的標(biāo)志[16]。然而這些研究僅針對小鼠，目前尚缺乏針對人類的相關(guān)研究。

Koppelstaetter等[9]發(fā)現(xiàn)患者移植術(shù)前腎組織標(biāo)本中CDKN2A表達(dá)的水平被認(rèn)為是與供者年齡和術(shù)后移植腎功能明確相關(guān)的重要因素，CDKN2A同時與供者年齡和術(shù)后移植物功能相關(guān)，而端粒長短并未表現(xiàn)出相關(guān)性。因此，移植術(shù)前腎組織標(biāo)本的CDKN2A水平是較實(shí)際年齡更好的預(yù)測術(shù)后6月及12月移植腎功能的指標(biāo)[17]。

在術(shù)后組織學(xué)表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮的移植腎臟，根據(jù)皮質(zhì)腎小管表達(dá)p16水平所計算出的預(yù)期年齡要明顯大于它們的實(shí)際年齡。這提示存在p16衰老通路的上調(diào)，或“加速性衰老”[18]。也有其他的研究描述這種p16表達(dá)上調(diào)和組織間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮相關(guān)的現(xiàn)象[19]，并認(rèn)為其與移植腎功能衰退相關(guān)[20]。術(shù)后器官功能穩(wěn)定的移植腎臟，根據(jù)p16表達(dá)水平所計算出的預(yù)期年齡與實(shí)際年齡相符，而在功能減退、間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮的移植腎，由p16水平計算所得的預(yù)期年齡要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腎臟的實(shí)際年齡[20]。

腎移植術(shù)后p16表達(dá)增加的原因尚不清楚，同基因移植后p16仍維持于基線水平，而同種異基因移植后p16表達(dá)明顯增加，提示異基因供受者間的排斥反應(yīng)可能影響移植物p16的表達(dá)[16]。相似地，小鼠同種異基因移植與p16表達(dá)上調(diào)相關(guān)[15]。然而有趣的是，SA-βgal表達(dá)的增加僅與慢性排斥反應(yīng)相關(guān)，提示SA-βgal可能在纖維化的進(jìn)展中起到作用，而p16表達(dá)并沒有與纖維化明確相關(guān)的證據(jù)[17]。

非免疫因素也可能在腎移植術(shù)后p16表達(dá)增加起到一定作用。前面已經(jīng)提到，一個相對明確的例子就是長期使用環(huán)孢素[12]。眾所周知，長期使用環(huán)孢素會造成慢性組織學(xué)損傷[13]，然而這種現(xiàn)象可能存在一個多因素參與的復(fù)雜機(jī)制。對于體外培養(yǎng)的細(xì)胞的研究認(rèn)為，其機(jī)制與端?？s短、p53信號通路及p16信號通路均有關(guān)系[12]。

有對于小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，腎組織p16的表達(dá)與再灌注持續(xù)時間相關(guān)，但與缺血時間延長無明確相關(guān)性[21]。這種現(xiàn)象是否存在于人類臨床腎移植尚不清楚。有趣的是，一項關(guān)于人類的研究發(fā)現(xiàn)，冷缺血時間與p16表達(dá)并無關(guān)系[17]。

與關(guān)于動物的研究不同，對于人類的研究目前還非常有限，尚不能明確p16表達(dá)與移植腎功能損傷是否存在因果關(guān)系。并且目前難以評價p16的表達(dá)與人體衰老、異基因排斥反應(yīng)、缺血-再灌注損傷、免疫抑制劑腎毒性及其他腎移植術(shù)后可能存在的病變，對于移植腎功能衰退的進(jìn)程可能的相互作用及共同影響。Melk等[20]在此項領(lǐng)域中做了許多貢獻(xiàn)性的工作，證明在術(shù)后腎功能減退的移植腎臟中，p16表達(dá)增加。他的研究支持損傷的進(jìn)程與衰老相關(guān)，但不能明確它們之間是否為因果關(guān)系，以及存在怎樣的因果關(guān)系：加速的衰老進(jìn)程可能引起損傷，抑或損傷可能加速衰老的進(jìn)程，或二者同時存在？研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后移植腎功能不全的患者腎組織中除腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化的區(qū)域p16的表達(dá)增加，慢性化病變不明顯的區(qū)域p16表達(dá)也增加[20]，這說明p16并不是，或不僅僅是組織學(xué)慢性化病變的結(jié)果，而可能是造成損傷進(jìn)展的原因。然而，鑒于近期有研究發(fā)現(xiàn)p16表達(dá)可能阻礙纖維化的進(jìn)展[22]，衰老機(jī)制在移植腎慢性組織學(xué)損傷的貢獻(xiàn)尚需更多的工作闡明。

結(jié)論及展望

除了正常的老化過程，多種病理情況影響并加速衰老的進(jìn)程。目前大多數(shù)研究僅限于動物模型，相關(guān)理論是否適用于人類尚需進(jìn)一步認(rèn)識；盡管對于腎組織復(fù)制衰老的現(xiàn)象有了更深一步的了解，但具體誘發(fā)細(xì)胞衰老的原因、其效應(yīng)機(jī)制及在腎組織功能和形態(tài)學(xué)上的后果都還不清楚。關(guān)于細(xì)胞衰老的研究，為預(yù)測腎移植預(yù)后、評估免疫抑制劑及其他治療方案、進(jìn)一步認(rèn)識移植腎臟病變機(jī)制，提供一個新的視角、新的研究方法和認(rèn)識途徑，在腎移植領(lǐng)域?qū)@示其重要價值。另外值得一提的是，細(xì)胞衰老的現(xiàn)象和機(jī)制在原發(fā)腎臟疾病的研究與認(rèn)識也非常值得關(guān)注，在移植領(lǐng)域進(jìn)行相關(guān)研究，參考原發(fā)腎臟疾病的研究方法和結(jié)果進(jìn)行綜合分析和思考，應(yīng)當(dāng)會帶來更全面、更深入的認(rèn)識。

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