膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法同時(shí)測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物*

吳虹 王炎 溫棚 婁文勇 宗敏華

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

中藥何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根.生品具解毒、消癰、潤(rùn)腸通便之功效，炮制品則有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨等作用［1］.近年來(lái)的研究表明，何首烏在抗衰老、調(diào)血脂、提高免疫力等方面亦有獨(dú)到之處［2-3］.由于野生資源緊缺，人工栽培品日益增多，對(duì)不同采集地何首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)已引起人們廣泛的重視.何首烏主要含有 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(二苯乙烯苷)和蒽醌類活性成分［4］.中國(guó)藥典(2010年版)何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)二苯乙烯苷進(jìn)行定量控制，而何首烏的許多藥理活性卻與其含有的蒽醌類成分密切相關(guān).目前，已有多種分別檢測(cè)何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的方法，如分光光度法［5］、薄層色譜法［6］、高效液相色譜法［1，7-8］和高效毛細(xì)管電泳法［9-11］等.但同時(shí)分離檢測(cè)何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的研究甚少［4，12-14］，且采用的方法多是高效液相色譜法.迄今，有關(guān)同時(shí)分離檢測(cè)何首烏中二苯乙烯苷和5種蒽醌類成分(大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚)的毛細(xì)管電泳方法鮮見報(bào)道.對(duì)何首烏有效活性成分進(jìn)行同時(shí)分離檢測(cè)后，可以對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行更科學(xué)、全面的評(píng)價(jià).

毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代以來(lái)興起的一種新的分離分析技術(shù)，具有分辨率高、分析時(shí)間短、溶劑和樣品消耗量少、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、可同時(shí)分離測(cè)定多組分樣品等優(yōu)點(diǎn)，在藥物分析中的應(yīng)用日益廣泛.二苯乙烯苷分子極性較強(qiáng)，易溶于水，而蒽醌類化合物極性較小，難溶于水.通過在運(yùn)行緩沖液中加入濃度大于臨界膠束濃度(CMC)的表面活性劑，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法可以分離極性不同的中性物質(zhì)，因此，文中旨在建立一種同時(shí)測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法，為何首烏的質(zhì)量控制提供新的分析手段.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀，配有二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)，儀器控制、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集及處理采用儀器自帶的32 Karat 7.0軟件;未涂層熔融石英毛細(xì)管柱，57.0cm ×75.0 μm i.d.，有效長(zhǎng)度為50.0cm，購(gòu)自河北永年銳灃色譜器件有限公司;CP-225D電子天平和PB-10精密pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司生產(chǎn).二苯乙烯苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;產(chǎn)地為廣東德慶的制何首烏樣品由廣東藥學(xué)院嚴(yán)寒靜贈(zèng)送并鑒定;十二烷基硫酸鈉(SDS)，購(gòu)自Alfa Aesar公司;其余試劑均為分析純;水為雙蒸水.

1.2 緩沖液、對(duì)照品和樣品溶液的制備

分別配制濃度均為100 mmol/L的硼砂和SDS儲(chǔ)備液，各取適量配成不同濃度、不同pH值的硼砂-SDS-甲醇混合運(yùn)行緩沖液.

分別精確稱取二苯乙烯苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品4.00mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得到質(zhì)量濃度均為400mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存.

準(zhǔn)確稱取產(chǎn)地為廣東德慶的制何首烏樣品粉末(過100目篩)200.0mg，加入50mL甲醇，超聲處理15min后過濾.殘?jiān)謩e用10 mL甲醇洗滌2次，合并濾液減壓蒸餾除去溶劑后，用少量甲醇溶解提取物，然后定容至10mL.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

新毛細(xì)管在使用前進(jìn)行如下預(yù)處理:依次分別用甲醇沖洗10 min，蒸餾水沖洗2 min，0.1 mol/L鹽酸沖洗10 min，蒸餾水沖洗2 min，0.1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗10min，蒸餾水沖洗2min.每次操作之前，毛細(xì)管依次分別用0.1mol/L鹽酸、蒸餾水、0.1mol/L氫氧化鈉、蒸餾水和緩沖液各沖洗5 min;連續(xù)檢測(cè)時(shí)，每次進(jìn)樣前毛細(xì)管用緩沖液沖洗2min.

采用壓力進(jìn)樣方式，進(jìn)樣壓力為0.5 PSI、時(shí)間為10s，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，實(shí)驗(yàn)在恒溫(25℃)、恒濕(相對(duì)濕度為60%)的條件下進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 影響分離效果的因素分析

2.1.1 緩沖液的pH值對(duì)分離效果的影響

緩沖液的pH值不僅影響分析物的存在形式和狀態(tài)，而且影響電滲流的大小.因此，通過選擇合適pH值的電泳緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)電滲流及被分析物的荷電狀態(tài)，可改善分離度，使待測(cè)物得以有效分離.二苯乙烯苷和5種蒽醌類成分分子中都含有酚羥基，呈弱酸性，因此，采用較高pH值的緩沖液對(duì)分離有利.實(shí)驗(yàn)考察了運(yùn)行緩沖液的pH值由8.8變化至10.4時(shí)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖1.可以看出，當(dāng)緩沖液的pH值從8.8上升到9.6時(shí)，分離度隨pH值的增加而改善，在pH值為9.6時(shí)分離效果最好;當(dāng)緩沖液的pH值大于9.6時(shí)，遷移時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且大黃酸和大黃酚不能完全分離.因此適宜的緩沖液pH值為9.6.

圖1 緩沖液的pH值對(duì)二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物分離效果的影響Fig.1 Effect of of buffer solution pH value on separation of stilbene glucoside and five anthraquinones

2.1.2 緩沖液的SDS濃度對(duì)分離效果的影響

在膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)中，表面活性劑可影響待測(cè)組分在緩沖液中的分配特性和有效遷移率.緩沖液的SDS濃度對(duì)分離效果的影響如圖2所示，在所考察的SDS濃度(10～50 mmol/L)下，各組分的遷移時(shí)間均隨SDS濃度的增大而延長(zhǎng).當(dāng)SDS濃度低于20 mmol/L時(shí)，大黃素和蘆薈大黃素不能完全分離;當(dāng)SDS濃度為30 mmol/L時(shí)，大黃素和蘆薈大黃素的分離效果最佳;當(dāng)SDS濃度超過30mmol/L后，遷移時(shí)間明顯延長(zhǎng).綜合考慮，選擇適宜的SDS濃度為30mmol/L.

圖2 SDS濃度對(duì)二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物分離效果的影響Fig.2 Effect of SDS concentration on separation of stilbene glucoside and five anthraquinones

2.1.3 緩沖液的硼砂濃度對(duì)分離效果的影響

硼砂濃度直接影響各組分的淌度，硼酸離子濃度增大時(shí)，有利于其與蒽醌類化合物形成配合物，提高分離效率.緩沖液的硼砂濃度對(duì)分離效果的影響如圖3所示，各組分的遷移時(shí)間隨硼砂濃度的增大而延長(zhǎng).當(dāng)硼砂濃度低于15mmol/L時(shí)，大黃素和蘆薈大黃素均不能很好地分離;當(dāng)硼砂濃度大于15mmol/L時(shí)，各組分雖能很好地分離，但遷移時(shí)間大大延長(zhǎng);當(dāng)硼砂濃度為15mmol/L時(shí)，各組分在最短的時(shí)間內(nèi)得以有效分離，且峰形較理想.因此，為了提高分離效率，可認(rèn)為適宜的緩沖液硼砂濃度為15mmol/L.

圖3 硼砂濃度對(duì)二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物分離的影響Fig.3 Effect of Na2B4O7concentration on separation of stilbene glucoside and five anthraquinones

2.1.4 緩沖液的甲醇濃度對(duì)分離效果的影響

在MECC中，加入有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈、醋酸和二甲亞砜等)可以降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果;但隨著有機(jī)溶劑濃度的增加，待測(cè)物的表觀電泳遷移速率逐漸減小.此外，有機(jī)溶劑還可以通過改變背景電解質(zhì)的極性進(jìn)而影響分離效果.緩沖液中甲醇濃度在0～20%(體積分?jǐn)?shù)，下同)之間變化時(shí)對(duì)分離效果的影響如圖4所示.當(dāng)緩沖液不含甲醇時(shí)，大黃酚和大黃素甲醚的峰出現(xiàn)部分重疊;當(dāng)甲醇濃度大于5%時(shí)，各組分均能很好地分離;當(dāng)甲醇濃度大于15%后，各組分遷移時(shí)間顯著增加，大黃素甲醚峰展寬，這可能是因?yàn)闃悠吩诿?xì)管內(nèi)的遷移時(shí)間太長(zhǎng)而發(fā)生了吸附或?qū)α?綜合考慮分離度和分離效率，選擇適宜的甲醇濃度為10%.

圖4 甲醇濃度對(duì)二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物分離的影響Fig.4 Effect of methanol concentration on separation of stilbene glucoside and five anthraquinones

2.1.5 分離電壓對(duì)分離效果的影響

毛細(xì)管長(zhǎng)度固定后，分離電壓決定了電場(chǎng)強(qiáng)度，對(duì)分離柱效、分離度和遷移時(shí)間產(chǎn)生影響［15］.提高分離電壓可以縮短分離時(shí)間，但在高電壓下產(chǎn)生大量的焦耳熱也會(huì)影響分離效果.文中考察了分離電壓為15～25kV時(shí)對(duì)分離效果的影響.結(jié)果表明，各組分在所考察的分離電壓下均分離良好，遷移時(shí)間隨分離電壓的增大而明顯縮短.這可能是由于使用了甲醇作為添加劑，產(chǎn)生的焦耳熱較低，即使在25kV下分析物也沒有出現(xiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象.因此，選擇25kV作為分離電壓.

綜上所述，適宜的分離檢測(cè)條件為:運(yùn)行緩沖液由15mmol/L硼砂、30mmol/L SDS、10%甲醇組成，pH值為9.6，分離電壓為25kV.在此條件下，對(duì)含有6種對(duì)照品的混合液(各種對(duì)照品的質(zhì)量濃度均為50mg/L)進(jìn)樣分析，二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物在18min內(nèi)得以完全基線分離，毛細(xì)管電泳譜圖見圖5.

圖5 最佳毛細(xì)管電泳條件下二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的電泳譜圖Fig.5 Electrogram of stilbene glucoside and five anthraquinones under the optimum capillary electrophoresis conditions

2.2 線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性

在最佳分離檢測(cè)條件下，分別以質(zhì)量濃度均為50mg/L的二苯乙烯苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，其遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.06%、1.31%、1.61%、1.51%、1.35%和 1.15%，峰面積的RSD分別為1.46%、1.69%、1.94%、2.01%、2.87%和2.53%.精密配制一系列不同質(zhì)量濃度的二苯乙烯苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品溶液和空白溶液，以最佳實(shí)驗(yàn)條件分別進(jìn)樣，以分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，凈峰面積(待測(cè)組分峰面積減去空白溶液峰面積)為縱坐標(biāo)，考察文中方法的線性關(guān)系和檢出限(S/N=3)，結(jié)果見表1.

表1 二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限(S/N=3)Table 1 Linear regression equations，linear correlation coefficients，linear ranges and detection limits(S/N=3)of stilbene glucoside and five anthraquinones

2.3 樣品分析及回收率

在最佳分離條件下測(cè)定何首烏樣品提取液中所含的活性成分，結(jié)果見表2.為檢驗(yàn)該方法的可靠性，文中還進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn).首先準(zhǔn)確稱取產(chǎn)地為廣東德慶的制何首烏樣品粉末(過100目篩)200mg，然后加入一定量的質(zhì)量濃度為400 mg/L的各種對(duì)照品溶液，按照1.2節(jié)的方法提取活性成分并進(jìn)行測(cè)定，毛細(xì)管電泳譜圖見圖6，各成分分析結(jié)果見表2，二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的回收率為97.2% ～103.2%.

表2 樣品的成分分析結(jié)果及回收率Table 2 Component analysis results of sample and recoveries

圖6 何首烏樣品中二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的電泳譜圖Fig.6 Electrogram of stilbene glucoside and five anthraquinones in Polygonum multiflorum Thunb.sample

目前，已有利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷和5種游離蒽醌類化合物(大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚)的報(bào)道［13］，與其20min的測(cè)定時(shí)間相比，文中建立的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法縮短了測(cè)定時(shí)間，僅需18min，并明顯降低了溶劑消耗量.

3 結(jié)語(yǔ)

文中建立的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法可同時(shí)分離檢測(cè)何首烏中的二苯乙烯苷和5種游離蒽醌類化合物(大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚).在優(yōu)化的電泳條件下，二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物在18 min內(nèi)完全基線分離，檢出限為0.26～0.56mg/L，回收率為97.2% ～103.2%.該方法檢測(cè)精度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性高，而且簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低，適用于何首烏藥材中二苯乙烯苷和蒽醌類活性成分的測(cè)定，可為何首烏的質(zhì)量控制提供參考.

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